H10 - Basistechnieken van gentechnologie Flashcards
Recombinant DNA
Samengesteld uit fragmenten van verschillende oorsprong
Vreemd DNA-fragment in vector plaatsen, laten vermenigvuldigen door gastheercel
Cloneren
Klein fragment isoleren uit de grote massa en laten aanmaken in grote aantallen
1e fase cloneren
Aanmaak recombinant DNA
Gebruiken 2 soorten enzymen:
- Restrictie-enzymen = endonucleasen
- DNA-ligase
2e fase cloneren
Reproductie van recombinant DNA
Geschikte vector en gastheer nodig:
- Bacteriën: plasmide- en bacteriofaagvectoren
- Gisten: artificiële chromosomen
Plasmide
Extrachromosomaal, circulair en dubbelstrengs DNA-molecule
Repliceren autonoom
Mogelijk om grote DNA-moleculen binnen te laten dringen in bacteriën
Competente cellen
Bacteriën die worden behandeld om DNA-moleculen te laten binnendringen
Transformatie
Proces van inbrengen DNA in bacteriën
Bacteriofaag
Virussen uit dubbelstrengig lineair DNA-/RNA
Fragmenten omgeven door een eiwitmantel
Artificiële chromosomen
Structuur van normaal chromosoom
Laten toe grote DNA-fragmenten te kloneren
Gelelektroforese
Scheiding van DNA-fragmenten naar grootte (door gel)
Gebruiken van positieve pool
Southern blotting
Transfer van DNA-fragmenten van een gelmatrix op een membraan
(DNA is na blotting enkelstrengs gebonden op membraan)
Hybridisatie
Om bepaald fragment uit een poel van fragmenten te halen
> Gebruiken complementaire streng voor DNA
> Aangeboden fragment merken door inbouw radioactieve of fluorescente groepen
PCR
Polymerase Chain Reaction
Aanmaken van miljoenen copijen zonder te moeten cloneren
DNA-polymerase maakt complementaire streng vanuit oligonucleotide
Cycli van PCR
Denaturatie van DNA door verwarming
Aanhechting oligonucleotide op de strengen
Aanmaak van complementaire strengen door polymerase
Oligonucleotide
Synthetische DNA-moleculen van ongeveer 30 baseparen