Génétique 6 Flashcards
Introduction au diagnostic moléculaire
Définition du diagnostic moléculaire?
Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigenome
~ ___ nouveaux tests cliniques disponibles par jour
10
Combien de tests disponibles en ce moment?
Plus de 60 k
% de tests qui testent un panel de gènes?
10%
Que doit posséder un laboratoire diagnostic afin d’assurer la plus grande confiance dans les résultats?
- Formation
- Design du laboratoire
- Contrôles de qualité
- Programmes d’assurance de la qualité
- Accréditation
Décrit l’ADN.
nb de liens H, charge et constitution
Acide nucléique = sucre + phosphate + base
Charge négative (phosphate)
Liens hydrogène
* G-C : 3
* A-T : 2
Décrit la structure du gène, de gauche à droite.
- 5’ UTR
- Promoteur
- Codon d’initiation
- Exon (GT)
- Intron
- Codon STOP
- 3’ UTR
Fin d’exon?
GT
Début exon?
AG
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome non pathologique?
Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associée à une pathologie génétique
Qu’est-ce qu’une variabilité du génome pathologique?
Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
Est-ce qu’on possède beaucoup de variations sur notre génome?
Oui, plus de 5-6 M
Est-ce que la plupart de nos variations sont pathologique?
Non
Que peuvent être les variations non pathologiques?
- Dans régions non codante
- Polymorphisme
- Touche un gène qui s’exprime seulement à l’état récessif et il n’y a pas une seconde variation
Causes externes des variations génétiques?
- Radiations
- UV
- Chimique
Causes internes des variations génétiques?
- Dépurination
- Déamination
- Radicaux libres
- Erreurs de la polymérase
- Erreur de réplication
- Méthylation
Les dinucléotides CG sont des endroits de prédilection pour les ________
mutations
Décrit la mutation la plus fréquente des îlots CpG
- C →methyl-C
- Methyl-C →U
- U→T
- CG → TG
Nomme les 3 types de variations selon la taille.
Grandes: CNV, LINE
Moyenne: microsatellites
Petites: SNP, indels
Que sont les microsatellites?
Répétition d’une petite séquence (ex: CA)
Que sont les SNP?
Changement d’un seul nucléotide
En quoi sont classés les petits réarrangement?
- Substitution
- Insertion
- Délétion
En quoi sont classés les substitutions?
Transition
Transversion
En quoi sont classé les insertions?
Mutation dynamiques
En quoi sont classés les grands réarrangements?
Insertion
Délétion
Équilibré
Quelle mutation est la plus fréquente?
Substitution
Nomme les 4 conséquences possibles des variations.
- Homologue (silencieux)
- Faux-sens (missense)
- Non-sens (nonsense)
- Altération du cadre de lecture (frameshift)
Homologue?
Change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé
Faux-sens?
Change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
Non-sens?
Change le codon pour un codon stop
Frameshift?
Insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une modification du codon et de ceux en aval
Éléments à considérer pour évaluer le degré de danger d’une mutation?
- Fréquence population
- Conservation
- Impact ARNm
- Impact sur la protéine
- Fonction du gène
Gène récessif?
Le phénotype est exprimé seulement à l’état homozygote
Dominant?
Le phénotype est exprimé à l’état hétérozygote
Perte de fonction?
Une réduction dans la quantité de la protéine produite, ou une réduction de l’activité de la protéine, entraîne le phénotype
Gain de fonction?
Une augmentation dans la quantité de la protéine produite, une augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraîne le phénotype
Nomme les 5 mécanismes associés aux gains de fonction.
- Augmentation du dosage génique
- Altération de l’expression de l’ARNm
- Activité accrue de la protéine
- Nouvelle fonction de la protéine
- Altérations toxiques à la protéine
Exemples de mutations dynamiques?
- Steinert
- X fragile
- Huntington
But de l’isolation génétique?
Isoler l’ADN du reste du contenu cellulaire (majoritairement protéines)
Quelles cellules sont utilisées pour l’isolation de l’ADN?
Cellules nucléées (sang: leucocyte)
De quoi faut-il se servir pour isoler l’ADN?
Il faut se servir des caractéristiques spécifiques de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire
Nomme les deux produits utilisé pour isoler l’ADN.
Phénol-Chlorophorme
Sels chaotropiques
Que fait l’ADN en présence de sels chaotropiques?
Adsorbe sur colonne de verre/membrane
Que font les autres substances en présence de sels chaotropiques?
solubles dans l’eau
Avantages des sels chaotropiques?
Non-toxique
Automatisable
Réaction de l’ADN en présence de Phénol-Chlorophorme?
Hydrosoluble
Réaction des autres composantes en présence de Phénol-Chlorophorme?
Phase organique
Désavantages du Phénol-Chlorophorme?
Toxique
Nomme les deux technique qui permettent d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN.
- Densité optique
- Teintures intercalantes (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
Que fait la densité optique?
- λ 260nm = absorbance max ADN (280mm pour protéines)
- Estimation de la quantité de l’ADN (ratio 260/280 estime pureté)
À quoi servent les teintures intercalantes?
- Composés qui se fixent à l’ADN double brin
- Estimation de la quantité et de la taille de l’ADN
De quoi est formé la sonde?
- Séquence d’ADN complémentaire
- Marquage (fluo, radioactif)
La détection du signal indique la présence de la _____________________.
séquence complémentaire
Qu’est-ce que l’électrophorèse capillaire?
On sépare les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (e.g. Agarose)
Nomme une technique sur l’ADN génomique.
Buvardage Southern
Nomme des exemples de techniques sur produits de PCR.
- PCR-migration (fragment sizing)
- Allele-specific oligonucleotides
- PCR-digestion
- Allele-specific primer extension (ASPE)
- PCR-séquençage
- PCR en temps réel
- MLPA
Qu’est-ce que le buvardage Southern?
Technique qui combine électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par une sonde marquée complémentaire à l’ADN cible
Nomme les 5 étapes du buvardage de Southern.
A. Digestion de l’ADN génomique
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane
D. Hybridation
E. Détection par autoradiographie
Que permet de quantifier le buvardage de Southern?
Les grandes expensions
Nomme les composantes (6) de la réaction de PCR.
- ADN du patient
- Amorces
- Polymérase
- Nucléotides
- Tampon (ions, magnésium)
- Autres additifs si nécessaire
La PCR fait _________ la quantité d’ADN à chaque cycle
doubler
Nb d’ADN si 30 cycle de PCR?
2^30
Que permet de détecter le PCR-migration?
Permet de détecter des insertions ou des délétions
Qu’est-ce que le PCR migration?
- Électrophorèse capillaire des produits de PCR
- Détection du signal - la distance où se situe la bande par rapport au puits reflète sa taille
Applications du PCR migration?
Analyses d’identité génétique:
* Instabilité des microsatellites
* Contamination foeto-maternelle
* Judiciaire
Insertions et délétions récurrentes
Qu’est-ce que le PCR digestion?
Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique
Desing du PCR digestion?
mutation crée ou abolit site de restriction
Exemples d’un PCR digestion?
- EcoR1 coupe à G_AATTC
- Dra I coupe à TTT_AA
Applications de la PCR digestion?
- Mutations ponctuelles récurrentes
- Il est habituellement possible de trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
Qu’est-ce que “Allele Specific Primer Extension”?
- Amplification PCR
- Jeu d’amorces marquées fluorescence dont certaines ont mismatch 3’
- Extension ssi match 3’
- Détection
Caractéristique de l’appareil pour le séquençage Sanger?
Appareil qui permet l’électrophorèse sur gel (polymère) et détection de fluorescence avec précision de 1 nuléotide
Étapes du séquençage Sanger?
- Amplification PCR
- Dénaturation
- Réamplification avec mélange de nucléotides et de nucléotides modifiés qui sont marqués par la fluorescence
Caractéristiques des ddNTP?
pas de -OH au C3 du ribose (chain termination)
L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est __________.
aléatoire
Applications du séquençage de Sanger?
- Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène
- Méthode de choix pour substitutions
- Bonne méthode pour petites insertions ou délétions
- Ne détecte pas les grandes anomalies de dosage
Qu’est-ce que le PCR temps-réel?
Réaction de PCR avec détection du produit simultanée
Possibilités du PCR temps-réel?
- Discrimination allélique
- Quantification (relative/absolue)
Décrit l’essai TaqMan.
- La sonde TaqMan est composée d’un rapporteur et d’un «quencher»
- La sonde se lie à l’ADN de même que l’amorce
- La Taq libère le rapporteur ce qui génère de la fluorescence
Décrit le PCR temps réel pour discrimination allélique.
- Amorce marquée
- Sonde marquée
- Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations
Décrit le PCR temps réel quantitatif.
- On fixe un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence (RFU))
- Ce seuil est le même pour tous les patients testés
- Comme dans la PCR la quantité d’ADN double à chaque cycle
Explique le résultat de ce scénario:
Échantillon 1, seuil atteint après 24 cycles (n)
Échantillon 2, seuil atteint après 25 cycles (n+1)
Puisque le nombre de molécules d’ADN double à chaque cycle, et que le seuil est le même pour les deux échantillons, il y avait 2X moins d’ADN dans l’échantillon 2 au départ
À quoi sert MLPA?
Recherche de délétions ou duplications
Méthode de MLPA?
- Sonde en deux sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient
- Ligase scelle ensuite les 2 sous-unités
- Amplification PCR
- Électrophorèse capillaire
Que permet le SNG?
- Permet de multiplier l’information obtenue d’une analyse
- Possible d’analyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps
Comment fonctionne le SNG?
- Fragmentation de l’ADN
- Liaison d’adapteurs
- Capture
- Amplification en //
- Séquençage en //
- Analyse bioinformatique
Décrit la partie d’analyse bioinformatique.
- Il faut procéder à l’alignement de ces séquences au bon endroit du génome humain
- Ensuite identifier si des variations de séquence sont présentes
- Ensuite déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
Le _% du génome qui contient les régions codantes
1
Nomme les deux applications du SNG.
- Exome
- ADN foetal circulant
Décrit l’ADN foetal circulant.
- Produit par l’unité placentaire
- Courte taille
- Courte T½
- Variation absente chez la mère
Qu’est-ce qui nous permet de reconnaitre le début d’un exon et d’un intron?
Des séquences particulières
Qui a la plus grande diversité d’allèle entre les microsatellites et le SNP?
Microsatellites
Quelle région a besoin d’avoir plus de triplets répétés pour être muté, exon ou intron?
Intron
Vrai ou faux? Toutes les polymérases font des erreurs.
Vrai
Vrai ou faux? Toutes les polymérases ont le même taux d’erreur?
Faux
Nomme trois façons de fragmenter l’ADN pour le SNG.
- Sonication
- Nébulisation
- Digestion
En quoi consiste la capture?
Tu choisis les séquences du génome que tu veux séquencer (ex: exome)
Que comprends la lisaison d’adaptateurs?
- Liaison d’adaptateurs
- Ajout code barre
Qu’est-ce que l’amplification en //?
PCR sur une flocelle
Qu’est-ce que le séquençage en //?
Hybridation avec nucléotides fluorescents, un par un
À quoi sert le SNG pour l’exome?
Trouver un CNv pathologique pour un patient (certains sont aux même endroit, d’autres non)
À quoi sert le SNG pour l’ADN foetal circulant?
- Sexe foetus
- Facteur Rh
- Trisomie
