Fragen Bucher: Teil 3 Flashcards
Welche Methoden gibt es, um herauszufinden, in welchen Zellen ein Gen aktiv ist und wie
funktionieren sie?
Whole mount in situ hybridization
- markierte antisense Probe herstellen
- Hybridisieren
- Antikörper mit gekoppeltem Enzym/fluoreszentem Farbstoff hinzugeben
- Signaldetektion
Immunhistonchemie/Antikörperfärbung
- Spezifischen Antikörper herstellen (Primärer Antikörper)
- primären Antikörper zugeben
- sekundären Antikörper gekoppelt mit Enzym oder fluoreszentem Protein
- Farbreaktion/Detektion Fluoreszenz
- Welche Zellen verfärben sich
- Wo in der Zelle ist das Protein lokalisiert?
Reportergene & Enhancer Trap
Reportergene zeigen Expression an, interferieren aber möglichst wenig mit der Funktion anderer Gene/Proteine. (EGFP/LacZ)
Enhancer trap durch Insertions-Mutagenese:
- Marker und EGFP wird “zwischen Gene eingebaut”
- Bei einer Insertion in das Gen - letale Mutation
Insertionsmutagenese = Stamm mit Marker + Reportergen wird mit Stamm mit Transposase Gen gekreuzt. - Aktives Transposon inseriert Gene.
Gene-Trap
Bei der Gene Trap wird das Reportergen samt Marker an das Zielgen angehängt (Ohne eigenen Promotor.) Das entstehende Fusionsprotein kann nun auch lokalisiert werden (Ist markiert.)
Mit CRISPR/Cas9 können Enhancer/Gen traps gezielt vermittelt werden!
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen und wie
funktionieren sie?
→ DNA-Arrays
- Genspezifische DNA-Moleküle auf Glas “drucken” (Nach Vermehrung mit PCR)
- 2 Proben, verschiedenfarbig gelabelt hinzugeben
- Auswaschen - “Unverbundene” Proben werden abgelöst
- Wo wird welche Farbe wie stark exprimiert?
- Haben sich die Farben vermischt?
- Welches Gen wird in welchem Sample wie stark exprimiert?
+ Viele/Alle Gene gleichzeitig ablesbar (Maschinenlesbar) - Experimentelle Variabilität (mRNA Isolation, Hybridisierung,…)
- Mehrere Replikate nötig
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen und wie
funktionieren sie?
→ qPCR (Quantitative real time PCR)
- RNA-Isolation/Zerstörung aller DNAs
- Zugabe von Genspezifischen Primern
- Reverse Transkriptase (RNA –> DNA)
- Zugabe von Farbstoff, der nur wenn DNA bindet fluoresziert
- PCR + Messung des Farbstoffs
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen und wie
funktionieren sie?
→ RNA-seq
Next Generation Sequenzing (Illumina) - Hybridisierung DNA mit Adapter - Zugabe auf Platte mit Primern - Wo bilden sich Cluster? - Laserbestrahlung - Welche Farbe - Welche Base \+Viele aber kurze Sequenzen
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen und wie
funktionieren sie?
→ PacBio
Messung des Einbaus eines Nucleotids durch eine Polymerase!
+ Lange Sequenzen, viele Fehler
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen und wie
funktionieren sie?
→ Allgemeines RNA sequ.
- mRNA Isolation
- cDNA Bibliothek
- Scheren der cDNA-Moleküle
- Sequenzier-Bibliothek herstellen
- Sequenzieren
- Mappen der reads auf das Trankriptom (Reads pro Transkript - Vergleich mt/wt)
Fluoreszenz‐Mikroskopie
Bei der klassischen Fluoreszenz-Mikroskopie wird das Objekt direkt Betrachtet. Die emittierte Strahlung wird gefiltert und zum Augenstück übertragen. Das Bild ist durch “Störlicht jedoch unscharf.” – Mehrere Ebenen
konfokale Mikroskopie
Bei der konfokalen Fluoreszenz Mikroskopie wird das Objekt punktuell mit einem Laser bestrahlt. Die emittierten Strahlen müssen einen Spiegel gegen nicht fluoreszentes Licht und ein “confocal pinhole” passieren. So wird Streulicht von “out focus” (Ebenen über und unter dem Schärfebereich) Bereichen weitgehend abgehalten. Der Computer setzt ähnlich REM ein Bild aus der Anzahl der wahrgenommenen Elektronen zusammen. Es entspricht einem Optischen Schnitt.
Welche Methoden gibt es, um die Höhe der Genexpression zu bestimmen?
qPCR
DNA-Arrays
RNA-seq
PacBio
