Fragen Bucher: Teil 2 Flashcards
Wie ist ein Transposon aufgebaut?
Transposons besitzen inverted repeat sequences. Dazwischen liegt das “Zielgen”.
Die Transposase kann diese inverted repeats nun aufspalten und das zwischenliegende Gen in das Zielchromosom einsetzen.
(Inverted repeat - Enhancer - Promotor - Zielgen - Inverted repeat)
Wie muss ein Transposon verändert werden, damit es
universell für die Transgenese in vielen Organismen geeignet ist?
Die Transposase muss ohne Wirtsfaktoren auskommen. (Bsp.: piggy Bac)
Es muss ein universeller Selektionsmarker vorhanden sein. (Bsp.: EGFP)
Universaler Enhancer muss vorhanden sein.
Wie funktioniert CRISPR/Cas9, wie kann es zur Genomeditierung angewendet werden?
Cas9 ist ein Protein. Es bindet eine single giude RNA mit fast beliebiger Zielsequenz.
Die exogene DNA wird durch den Cas-Proteinkomplex erkannt und als neue Spacer in die CRISPR Bereiche integriert.
Der gesamte CRISPR Bereich wird in eine pre-crRNA translatiert.
Anschließend - pre-crRNA wird zerteilt.
Cas9 verbindet sich mit fremden RNA Sequenzen (Über tracer-RNA), steuert virale DNA an, schneidet sie.
So kann man in CRISPR ein Zielgen einsetzten, welches anschließend durch Cas9 in die Zielsequenz eingefügt wird.
- Insertion von Transgenen
- Gezielte Mutation in Kandidatengenen (Rückwärtsgenetik)
Was ist der Unterschied von homologer Rekombination und nicht‐homologer Insertion durch
Crispr/Cas9?
Bei der homologen Rekombination wird das Gen samt positivem Selektionsmarker übertragen. Der negative Selektionsmarker verbleibt mit der eingefügten Zielsequenz auf dem “Konstrukt”.
Bei der nicht homologen Insertion wird die Wunschsequenz mitsamt dem negativen Marker getauscht. “Es wird zu viel DNA zwischen dem Konstrukt und der genomischen Sequenz ausgetauscht.”
Welche Methoden zur Missexpression von Genen gibt es und wie funktionieren sie?
Hitzeschock-vermittelten Missexpression
binäre Missexpressionssystem
Hitzeschock-vermittelten Missexpression:
Bei der Hitzeschock-vermittelten Missexpression wird ein Hitze-sensitiver Enhancer vor den Promotor und die zu codierende Sequenz eingebaut.
Somit kann die Expression zeitlich kontrolliert werden. Jedoch gibt es immer eine ubiquitäre Expression.
binäre Missexpressionssystem
Das binäre Missexpressionssystem funktioniert mit Gal4/UAS. Hierbei ist UAS ein Enhancer und Gal4 der aktivierende Transkriptionsfaktor. Es werden 2 Transgene Stämme angezüchtet. Der erste besitzt Gal4, welches exprimiert wird. Der zweite hat UAS vor ein Zielgen (Beispielsweise Pax6) eingebaut. Getrennt voneinander zeigen beide “Veränderungen” keine Wirkung.
Werden nun die beiden transgenen Stämme verkreuzt wird Gal 4 am gewünschten Ort exprimiert (Bsp.: Bein Enhancer - Bein.) und kann UAS aktivieren, welches wiederrum die Expression vom Zielgen (Bsp.: Pax6) fördert und zur Missexpression führt.
Enhancer können über gain of function oder Transgenese gefunden werden. So wird beispielsweise das Gen even skipped zerschnitten und mit EGFP markiert. Die Abschnitte, die den Enhancer beinhalten exprimieren EGFP und es kommt zur Fluoreszenz. Den “getesteten” Abschnitt zerschneidet man nun weiter und wiederholt das Vorgehen.
