Eukaryot Transcription Flashcards
Alla olika celltyper i en multicellulär organism innehåller:
samma DNA.
Om man tar cellkärnan från en hudcell och sätter in den i en äggcell utan cellkärna så Kommer grodan:
utvecklas normalt- hudcellen innehåller all information !!
Från studier där man studerat RNA uttryck i olika celler har man noterat att celler uttrycker mellan____ av sina 30 000 gener?
30-60%
Det finns ung 21000 protein-kodande gener och 9000 non-koding RNA gener i humans. När man tittar på mönstret på RNA uttrycket i olika humana cell typer så ser man att nivån av nästan alla gener____ från en celltyp till en annan.
varierar
Olika celltyper kan uttrycka olika gener ( som kodar för RNA och proteiner) men vissa är gemensamma för alla celltyper.
Förklara detta.
- Många processer är samma i alla celler så vissa gen produkter uttrycks i alla celler tex RNA och DNA polymeraser, reparations proteiner, enzymer som är involverade i den ”normala” metabolismen och många av de gener som formar cytoskelettet såsom aktin. (Jmf med housekeeping genes in prokaryoter)
- Tyrosin aminotransferas (bryter ner tyrosin i mat) uttrycks i levern men inte i andra celltyperna.
Även om det är en stor skillnad av mRNA nivåer mellan olika celltyper så kan skillnaden underskattas, varför?
eftersom det finns en massa steg efter RNA produktionen som kan påverka proteinkoncentrationen av ett speciellt protein!!
Hur många nivåer finns de att påverka koncentrationen av ett protein i eukaryoter? Vilka är dem?
7 st
Hur många RNA-polymeraser har den eukaryota kärnan? Vilka är dem?
RNA polymeras I - de flesta rRNA gener
RNA polymeras II - alla proteinkodande gener, miRNA-gener och gener för andra icke-kodande RNA (ex. de i spliceosomer)
RNA polymeras III - tRNA-gener, 5S rRNA gener och gener för många andra små RNA
Mitokondriellt RNA polymeras (ses utanför)
Vad är:
- snRNAs
- miRNAs
- siRNAs
- *snRNAs** = small nuclear RNA-splicing
- *miRNAs = microRNA**- regulate gene expression by blocking translation
- *siRNAs =** small interfering RNA- turn of geneexpression by directing degradation.)
RNA polymerase I, II and III har flera subenheter gemensamt men har några specifika. Den viktigaste specifika är ___ och den tillhör___
CTD hos POL II
Den största subenheten av RNA polymerase II innehåller en essential C-terminal Domän (CTD) som består av:
Heptapetide Repeat (52X) = Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser- Pro-Ser
Alla tre polymeraserna har fem subenheter som är homologa till: ______ + ytterligare ____ gemensamma
till 2 alfa, b, b’ och w (omega) subenheterna i E.coli RNA-polymeraset.
+ ytterligare 4 gemansamma
RNA polymeras II ansvarar för:
syntesen av mRNA
mRNA:t i eukaryoter processas:
på massa olika sätt jmf med hos prokaryoter
Vad behöver RNA-polymeras för att binda till rätt promotor?
Generella transkriptionsfaktorer (GTF)
Ge exempel på generella transkriptionsfaktorer och dess roll i transkriptions-initiering av RNA polymeras II?
TFIID, har subunits TBP (1) och TAF (11)
- TBP känner igen TATA-boxen
- TAF känner igen andra DNA-sekvenser nära transkriptionens startpunkt och reglerar DNA-bindning av TBP
TFIIB - känner igen BRE-element i promotorn. Accurately placerar RNA polymeras i transkriptionens starting site
TFIIF stabiliserar RNA polymeras-interaktionen med TBP och TFIIB. Hjälper även att locka till TFIIE och TFIIH
TFIIE attraherar och reglerar TFIIH
TFIIH virar upp DNA vid transkriptionens startpunkt, fosforylerar Ser5 från RNA polymerasets CTD. Frigör även RNA polymeras från promoton
Beskriv initieringen vid eukaryot transkription
Vad händer när RNA-polymerasets ska binda till operonet?
- TBP är en subtyp av tf2d som binder till tata-box
- TF2b binder sedan in till komplexet vilket rekryterar rna-polymeras 2
- tf2f stabiliserar dna polymerasets interaktion med komplexet
- tf2e rekryterar tf2h till promotor
- tf2h:
- Har helikas-aktivitet som skapar en transkriptionsbubbla vid startstället så att template-strängen exponeras och vi får ett “open complex”. Detta kräver ATP
- Fosforylerar CTD-svansen på RNA-polymeras II som då lossnar från de andra transkriptionsfaktorerna och genen börjar transkriberas
Vad är TATA boxen?
En DNA-sekvens dit TBP och TFIID binder in på operonet
Denna sekvens ligger 30 nukleotider uppströms från transkriptionens startställe
Vad är preinitiation complex och vad är dess funktion?
- Komplex av RNA polymeras II och 6 st generella transkriptionsfaktorer: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIE och TFIIH.
-
Komplexet:
- positionerar RNA-polymeras vid gen transcription start sites
- denaturerar DNA och positionerar DNA:t som ska transkriberas i RNA-polymeras II aktiva säte
Vilka två viktiga funktioner har TFIIH?
- Har helikas-aktivitet som skapar en transkriptionsbubbla vid startstället så att template-strängen exponeras och vi får ett “open complex”. Detta kräver ATP
- Fosforylerar CTD-svansen på RNA-polymeras II som då lossnar från de andra transkriptionsfaktorerna och genen börjar transkriberas
Vilka tre faktorer behövs när TFIIH fosforylerar CTD så att elongeringsfasen i transkriptionen kan börja?
- Capping-faktorer
- Splicing-faktorer
- Polyadynelering-faktorer - faktorer som processar 3’-änden
När transkriptionsfaktorn TFIIH fosforylerar CTD på Polymeras II så signalerar det att:
initieringen är klar och Elongeringsfasen kan börja.
Beskriv elongeringsproteinernas funktion i elongeringsfasen av transkriptionen?
Elongeringsproteiner binder in till Polymeras II och dessa stimulerar Pol II aktiviteten så att Pol II blir processivt
(Förhindrar att transkriptionen pausas)
Vad innebär det att ett enzym är mer eller mindre processivt?
Processivitet = ett enzyms förmåga att katalysera “reaktioner i följd utan att släppa sitt substrat”
Ex. antalet nukleotider ett polymeras kan addera i transkriptionen innan det lossnar från sin template strand
Vad är polyadenylering?
När en poly-A-svans (lång nukleotidsekvens med massa AAAAA) adderas till 3’-ändan av mRNAt i slutet på transkriptionen
Hur tror man att terminering av transkriptionsförloppet går till?
Inte helt klart, men man tror att:
- mRNAt klyvs ca 1000 baser downstream efter translationsstoppet och att mRNAt sen polyadenyleras i 3’ änden
- Efter detta frisläpps RNA polymeras II och CTD-tailen på mRNAt defosforyleras
RNA pol kan starta ny transkriptionscykel
Vad är mediatorn för något när vi pratar om eukaryot transkription?
- Mediatorn är ett stort proteinkomplex med mer än 20 subenheter.
- Den interagerar med generella transkriptionsfaktorer och RNA polymeras i transkriptionen
Beskriv mediatorns funktion
- Den interagerar med generella transkriptionsfaktorer och RNA polymeras i transkriptionen
Mediatorn lägger sig som ett “täcke” över RNA pol II ⇒ RNA pol II får ökad interaktionsyta ⇒ blir mer mottaglig till input, fler proteiner kan påverka transkriptionsnivåerna
Det finns en viktig skillnad i trnskriptionsreglering om vi jämför eukaryoter och prokaryoter, vilken är denna? Vilket begrepp beskriver detta?
- Eukaryoters DNA är packat med kromatin. Modifieringar i kromatinstruktur spelar en viktig roll när för reglering av genuttryck i eukaryota celler
- Epigenetik
Vilka tre stora grupper av “hjälpmolekyler” behöver RNA polymeras II för att utföra transkription?
- Aktivatorer
- Mediatorn
- Kromatinmodifierande proteiner
Vad kallas de sekvenser dit regulatoriska proteiner binder in till?
enhancer
Promotorn är den DNA sekvens där de generella transkriptionsfaktorera och polymeraset binder. De regulatoriska sekvenserna (enhancer) fungerar som bindningställe för regulatoriska proteiner vilkas närvaro på DNA:t reglerar hastigheten på transkriptionen. Samma gen kan ha flera enhancers
Vad händer när ett regulatoriskt protein binder in till en enhancer under transkriptionen?
Hastigheten på DNAts transkription regleras
Spelar det någon roll var de genregulatoriska proteinerna binder in på en DNA sträng? Varför/varför inte?
Nej, Enhancer sekvensen/er kan ligga angränsande, långt uppströms, långt nedströms eller i en intron av genen.
eftersom DNA looping gör att de genregulatoriska proteinerna ändå kan interagera med proteiner vid promotorn även om de hamnar långt bort på strängen
Beskriv översikligt Eukaryotic Transcription i en bild
Enhancers binder och reglerar:
transkriptionsfaktorer och reglerar RNA polymeraset aktivitet vid en viss gen.
DNA looping tillåter:
transkriptionsfaktorer att binda långt från promotorn men ändå interagera med RNA polymeraset/Mediator komplexet vid promotorn.
Hur många domäner har de regulatoriska transkriptionsfaktorerna? Vad är deras funktion?
2 st
- En domän som binder till DNA:t
- En aktiverande domän som stimulerar transkriptionen
Hur fungerar den aktiverande domänen på regulatoriska transkriptionsfaktorer?
Enligt 2 mekanismer:
- Den interagerar med mediator-proteiner eller de generella transkriptionsfaktorerna
- Genom att modifiera kromatinstrukturen (alltså styra DNA-looping)
Vad är insulator elements? Hur fungerar dem?
- De är DNA sekvenser som hindrar eukaryota genregulatoriska proteiner att influera andra närliggande gener än de gener de är specifika för
- Insulator binding proteins kopplar samman två insulator-element och bildar en hairpin struktur med dem så genen isoleras och bara den påverkas av rätt enhancer
Ge tre exempel på hur repressor-proteiner kan reglera transkriptions-initiering?
- Direkt blockering av bindnings-sites för generella transkriptionsfaktorer
- Kompetitiv DNA bindning - när repressor-protein tävlar med aktivator för att binda specifik reglersekvens
- När både aktivator och repressor bundit till DNA och repressor binder till aktiveringsdomän på aktivatorn så den inte kan aktivera sitt genuttryck
Hur reglerar microRNA mRNAs translation?
MicroRNA binder in till komplementära mRNA sekvenser och märker in mRNA stranden för nedbrytning
Beskriv väldigt kort vad RNA-internferens är?
dubbelsträngat RNA kan tysta en gen så att den inte uttrycks. Detta kan ses som ett slags immunförsvar för genomet.
Jämför RNAi och Crispr/Cas9
Ge för- och nackdelar med de båda metoderna?
RNAi - Tillfällig knock down
Fördelar:
- Snabb, tar ca 1 vecka.
- Fungerar på essentiella protein
Nackdelar:
- Kortsiktig (proteinkonc sjunker bara i några dagar)
- Nivå av knock down kan variera mellan försök, lite osäkert
Crispr/Cas9 - Permanent knock down
Fördelar:
- Permanent, kan ärvas
- Kan användas för att göra önskade mutationer i ett protein
Nackdelar:
- Tidskrävande (tar flera månader)
- Fungerar inte på essentiella proteiner
