DNA recombinante Flashcards
Secuencias de DNA derivadas de más de una fuente
DNA recombinante
Endonucleasas que reconocen palindromos (secuencias que se leen igual de derecha-izquierda a izquierda-derecha)
Enzimas de restricción
Endonucleasas que degradan ADN extraño/foráneo. Es un mecanismo de defensa de las bacterias frente a la entrada de ADN foráneo.
Enzimas de restricción
Tipos de enzimas de restricción
- Endonucleasas
- Enzimas del sistema de modificación
Se puede degradar el ADN metalado?
No, es inmune
¿Qué hacen las enzimas del sistema de modificación?
Metilan adenina o citosina del ADN propio para que no sea degradado
¿Qué hacen las endonucleasas?
- Degradan el DNA extraño
- Reconocen una secuencia palindrómica
- Cortan el ADN (enlaces fosfodiéster)
- Se producen por bacterias
La primera letra de los acrónimos da…
El género de la bacteria
La segunda y tercera letra de los acrónimos dan…
Nombre de la especie
¿Cuántos tipos de enzimas de restricción hay?
4
TIPOS DE ENZIMA DE RESTRICCIÓN.
Reconoce secuencias de DNA y cortan aleatoriamente al inicio (río arriba) o al final (rio abajo). Cortan lejos del sitio de reconocimiento (secuencia Diana).
Tipo 1
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Reconoce secuencias palindrómicas. El sitio de corte y de reconocimiento (secuencia Diana) es el mismo.
Tipo 2
TIPOS DE ENZIMA DE RESTRICCIÓN.
Tienen dos secuencias de reconocimiento. Cortan asimétricamente lejos (rio abajo) de la secuencia de reconocimiento.
Tipo 3
TIPOS DE ENZIMA DE RESTRICCIÓN.
Reconoce DNA metilado.
Tipo 4
Cortes en diferente posición (3 a 5 nt de diferencia)
Cohesivos
Cortes simétricos en ambas cadenas. No dejan pares libres.
Romos
El DNA recombinante y el DNA de interés se trata con una enzima de restricción que …
Genera cortes cohesivos.
Se deben cortar con la misma enzima de restricción.
Moléculas de dsDNA con capacidad de albergar y transportar un fragmento de DNA (exógeno) al interior de una célula huésped.
Vector
Molécula de DNA circular de doble cadena que puede albergar otra molécula de DNA
Plásmido
Vector.
Moléculas de DNA que transportan, almacenan y replican fragmentos de ADN en una célula huésped. Obtiene grandes cantidades de DNA. Plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos.
Vectores de clonación
Vector.
Busca producir un transcrito o proteínas. Plásmidos o bacteriófagos.
Vectores de Expresión.
Características de los vectores de clonación
- Punto ORI: origen de replicación
- Sitio de clonación múltiple: secuencias palindrómicas reconocidas por las enzimas de restricción para insertar DNA complementario
- Marcadores de selección: genes como resistencia el antibiótico, para saber que células se quedaron o no con el vector/plásmido
Características de los vectores de expresión
- Origen de replicación, sitio múltiple de clonación y marcadores de selección
- Promotor: caja TATA
- Secuencia de Poli A
- IRES: sitio de entrada al ribosoma
dsDNA circular, están separados del DNA cromosómico y es encontrado en bacterias y levaduras. Pueden replicarse de forma independiente dentro de la célula.
Plásmidos
Características de los Plásmidos
- Origen de replicación
- Gen de resistencia antibiótica
- Región de DNA exógeno
Virus que come bacterias. Se modifica genéticamente (elimina genes que no se requieren para la replicación y empaquetamiento)
Bacteriófagos
Vector híbrido mezcla entre fago y plásmido. Se combina el DNA de un plásmido (gen de resistencia a antibióticos y sitio ORI) con el de un bacteriófago (Cos empaquetamiento)
Cósmidos
Plásmido al que se le incorpora el origen de replicación de un fago. No tiene sitios cos.
Fagémidos
BAC (bacterias) y YAC (levaduras)
Cromosomas artificiales
Es el proceso mediante el cual una célula huésped incorpora material genético de manera extracromosómica (como un plásmido) y lo utiliza para replicación, transcripción y traducción.
Transformación celular
¿Qué es el ADN recombinante?
Es ADN formado al combinar fragmentos de ADN de diferentes fuentes, como un gen de interés insertado en un vector.
Primer paso de clonación molecular
- Preparación del inserto: Se corta el fragmento de ADN de interés con enzimas de restricción para que tenga extremos compatibles con el vector.
Segundo paso de clonación molecular
- Preparación del vector
- Las enzimas de restricción cortan el vector en los mismos sitios que el inserto.
- Desfosforilación: Se eliminan los grupos fosfato 5’ para evitar el cierre del vector sobre sí mismo.
- Purificación del vector: Se limpia el plásmido antes de usarlo.
Tercer paso de clonación molecular
- Ligación:
La enzima ligasa une el inserto y el vector, creando ADN recombinante
Cuarto paso de clonación molecular
Preparación de células competentes:
Se aumenta la permeabilidad de la membrana celular con: Glicerol 10% (protección) y CaCl₂ (neutraliza la carga negativa del ADN)
Quinto paso de clonación molecular
- Transformación celular:
Las células adquieren el ADN recombinante o gen exógeno (vector + inserto), incorporándolo de manera extracromosómica y adquiriendo un nuevo fenotipo (ej. resistencia a antibióticos).
Sexto paso de clonación molecular
- Identificación:
Se siembran las bacterias en un medio selectivo con:
- Antibiótico: Las células con el vector sobreviven.
- Marcadores: Ejemplo, GFP (brillo bajo luz UV) para verificar el éxito de la clonación.
Enzimas modificadas genéticamente que reconocen secuencias especificas en un dsDNA.
Nucleasas Programables
¿Cuáles son los mono meros de las nucleasas programables?
Son dos:
1. Un dominio de reconocimiento de la secuencia de DNA
2. Una nucleasa que corta la molécula de DNA en el sitio deseado
Nucleasa programables.
Mecanismos de acción después del corte de la nucleasa:
Disrupción: La reparación del ADN cortado puede generar errores que interrumpen la función del gen (útil para desactivar genes).
Inserción: Se puede insertar un fragmento de ADN nuevo en el sitio del corte (útil para agregar genes).
Deleción: Se pueden eliminar fragmentos de ADN entre dos cortes.
¿Para qué se usan las nucleasas programables?
Corregir y editar defectos genéticos
