Análisis y PCR Flashcards
La elección del método de extracción va a depender de:
- Tipo de Ac nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA y rRNA)
- Organismo de origen (procariota, planta, mamíferos y virus)
- Fuente (cultivo celular, tejido, sangre, suero)
- Ténica
Fuente del ácido nucleico
Sangre, suero, plasma, biopsia, orina, heces, LCR, líquido sinovial, líquido amniótico, esputi, semen, raspado bucal y folículo capilar
Extracción de DNA por fenol-Cloroformo
Técnica de extracción de DNA para medir la cantidad de DNA por medio del paso de un haz de luz en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene.
Espectrofotometría
Componentes de una PCR
Secuencia de DNA
Enzima DNA polimerasa
Desoxirribonucleotidos (dNTP)
Primers
Enzima que polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente
DNA polimerasa
Bacteria que no se desnaturaliza debido a la temperatura
Thermus aquaticus (Taq)
Cofactor de la taq polimerasa
Cloruro de Magnesio
Características de los iniciadores de la PCR
- Se usan para reconocer secuencias blanco en el DNA molde.
- Proporcionan un extremo 3’
- Tienen un alto contenido de GC.
Pasos de PCR
- Desnaturalización: separa cadenas de DNA (95°)
- Hibridación: debido a la temperatura de alineamiento (Tm) se alinean los primers
- Extensión: la taq polimerasa agrega dNTP’s complementarios para crear cadenas complementarias
Temperatura de los pasos de la PCR
Desnaturalización: 95° (20 a 30 segundos)
Hibridación: 50° a 60°
Extensión 72°
¿Qué se realiza al final de la PCR?
Gel de electroforesis
Técnica mediante la cual se separan las biomoleculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
Electroforesis
Elementos necesarios para la electroforesis
- Cámara de electroforesis
- Gel de agarosa
- Marcador de peso molecular
- Transiluminador violeta
¿Para que sirve la cámara de electroforesis?
Genera un campo eléctrico alrededor del gel. Tiene un polo negativo y uno positivo que se conectan a una fuente de energía.
¿Para que sirve el gel de agarosa?
Polisacárido extraído de algas marinas que separa fragmentos de DNA
¿De qué depende la concentración de agarosa?
Se escoge según el tamaño del acido nucleico que se vaya a analizar
Mezcla de moléculas de DNA o proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de las moléculas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis
Marcador de peso molecular
Principales tipos de PCR
- PCR punto final
- PCR Múltiple
- PCR-RFLP
- PCR transcriptasa reversa
- PCR tiempo real
PCR que amplifica un segmento de ADN usando dos partidores y lo detecta por un gel de agarosa.
Detectar cualitativamente un segmento de ADN
PCR punto final
PCR que amplifica 2 o más segmentos de ADN usando varios partidores en una sola reacción de amplificación.
Detección cualitativa de varios segmentos de ADN en una sola reacción de PCR.
PCR múltiple
PCR que usa enzimas de restricción. Detecta polimorfismos genéticos (SNP’s)
PCR-RFLP
PCR que sintetiza una cadena de AND a partir de ARN mediante transcripción reversa, seguido de una PCR.
Para expresión de genes o detección de virus ARN.
PCR transcriptasa reversa
PCR estándar donde se usan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados.
Para cuantificación de ADN en la muestra o expresión de genes.
PCR tiempo real
Sonda (para el gen que buscas) fluorescentes de oligonucleótidos con un reportero fluorescente
Sistema reportero de fluorescencia específicos
Moléculas intercalentes que tienen afinidad por el dsDNA y generan una señal fluorescente (el colorante solo detecta y se une a doble cadenas sea la que estás buscando o no)
Sistema de fluorescencia no específicos
Características de la PCR tiempo real
- Detecta los productos amplificados en cada ciclo de la reacción
- Cuantifica la cantidad de DNA en la muestra
- Método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos
