DNA-analys Och Genom Flashcards
Vad har PCR för syfte?
Polymerase Chain Reaction.
Användbart vid undersökning av en mindre sekvens/ region. T.ex. för att undersöka en känd mutation i en känd gen.
PCR isolerar och kopierar targetsekvensen.
Hur fungerar primers i PCR?
Två stycken, en på var sida av targetsekvensen som annealar till vars en DNA-sträng. 5’ - 3’. (Fäster vid stängens 3’-ände).
Vilka reagenser ska finnas i en PCR?
- DNA-prov
- Primers (L + R)
- dNTP´er (nukleotider = dATP, dTTP, dGTP dCTP)
- DNA polymeras
Vilka tre steg utgör PCR, och vid vilka temperaturer sker de?
- Denaturering, 95 C
- Annealing, 55-60 C
- Extension, 72 C
Vad används gelelektrofores till?
“Visualisera DNA”, Åtskilja DNA-fragment av olika storlek, Uppskatta längden av DNA-fragment.
Vad säger avståndet DNA-fragmenten vandrar mot pluspolen om dess storlek?
Små fragment vandrar snabbt/långt, stora fragment vandrar långsamt/kort.
När används typiskt restriktionsenzym?
För att undersöka DNA för kända mutationer (sekvenser).
Hur verkar restriktionsenzym?
Genom att känna igen och skära i specifika DNA-sekvenser = restriktionssites. Olika enzym känner igen olika sekvenser.
Vad kan molekylär kloning användas till?
Amplifikation/bevarande av stora DNA-fragment.
Expression av gener, t.ex. vid framställning av insulin, antibiotika.
Vilka två steg består molekylär kloning av?
- Ligering
- Transformering
Vad används gensekvensering till?
Att läsa ordningsföljden av baser i ett DNA.
T.ex. för att hitta mutationer eller jämföra genom mellan olika arter.
Vilka två steg utgör gensekvensering?
- PCR-liknande process med syntes av komplementära fragment av olika längder.
- Gelelektrofores
Vilka reagenser ingår i det PCR-liknande steget i gensekvensering?
- Target-DNA (förökat t.ex. genom PCR)
- DNA Polymeras
- dNTP’er
- 1 primer
- ddNTP’er (=terminatornukleotider. Färgade. ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP)
Vad är gelelektroforesens syfte i sekvenseringen?
Sortera de komplettära fragmenten efter storlek, och därmed i ordningsföljd. Kan göras i kapillär (tunt rör) och läsas av i sekvenseringsmaskin.
Vad är cDNA?
En “översättning” av mRNA till DNA för att kunna analysera enbart det kodande genomet. Detta eftersom mRNA är instabilt, och inte går att genomföra t.ex. PCR på.
Hur syntetiseras cDNA?
mRNA från vävnadsprov adderas med enzymet reverse transkriptase (RT), en poly-T-primer och nukleotider. Poly-T-primern fäster på poly-A-svansen och syntetiserar cDNA med mRNA som mall.
Vad är qPCR?
Kvantitativ PCR.
Används för att mäta expressionen av en eller ett fåtal gener åt gången.
Vilka steg ingår i qPCR?
- Vävnadsprov -> mRNA -> cDNA
- qPCR på target-cDNA med mätning av produktmängd efter var cykel.
Vad innebär det att ett prov uppnår tröskelvärdet i qPCR tidigare än ett annat?
Att genen uttrycks mer i det första provet.
n= antal cykler mellan att tröskelvärdena uppnås.
2^n = expressivitet i förhållande till varandra.
