Diagnostikk av mikroorganismer Flashcards
Hvilke spørsmål må man stille seg når man rekvirerer diagnostikk av mikroorganismer?
Hvilken metode?
Påvise med metoder der mikroben er levende eller agens?
- Agenspåvisning er det viktigste.
For ulike mikrober, er det ulikt materialet som kreves.
Kontaminering:
- “Forsøpling”
Gi noen eks. på prøvematerialer man bruker til å diagnostisere mikroorganismer?
Immunrespons; immunglobuliner
Hva må man vurdere ved funn av mikroorganismer?
Relevans?
De på laben rapportere relevante funn.
Hvordan systematiserer man bakterier?
Hvilke metoder bruker man for å se på bakterier ved direkte mikroskopi?
**Ziehl-Neelsen:**
Farger tuberkulosebakterien rød.
Ziehl-Neelsens fargemetode påviser syrefaste bakterier i snitt.
Avhengig av problemstillingen vil dette i de fleste praktiske tilfellene i et patologilaboratorium være mycobacterium tuberculosis, noe sjeldnere atypiske (Mycobacterium avium).
Metoden kan altså påvise begge disse bakteriegruppene, men er ikke spesifikke for noen av disse.
Det er derfor ingen "turberkuloseprøve".
**Problemer med sensitiviteten:**
Trenger mange bakterier for at de skal sees.
**Mikroskopifunn;**
Ikke en fastsatt diagnostikk, men ett hjelpemiddel i starten av en eventuell behandling.
Hvordan gramfarger man bakterier?
Hvordan inndeler man bakterier basert på morfologi?
Hva bruker man for å dyrke bakterier?
Selektive medier:
Hindre at enkelte mikroorganismer vokser.
Hvordan vokser bakterier?
Tre kategorier
Hva er det som gjør at storparten av bakteriene i tarmen ikke kan dyrkes i laben?
Vekst
Normalflora i halsen:
10^10 til 10^12 i halssekret.
Ved dyrkning, klarer man ikke å skille mellom 5-6 arter.
Hvordan skiller man på kolonimorfologien til bakterier?
Umbilical-hevning:
Foregår mye autolyse i kolonien.
Hvilke metoder kan man bruke for å identifisere bakterier?
Flere ulike metoder
Fyll inn
Hvilke typer hemolyse deler man inn i?
Bakterier
Hvordan er bakteriearter tradisjonelt blitt identifisert ved?
Hva er biotyping?
Hva skiller en katalasetest mellom?
Bakterier
Stafylokokker har katalase:
- Fører til “bobler”.
Hva skiller en koagulasetest mellom?
Bakterier
Hva er forskjellen mellom oksidativ og fermentativ metabolisme?
Hvilke andre, enkle tester kan man bruke for å identifisere bakterier?
Hva er MALDI-TOF?
Hvilke molekylærgenetiske metoder brukes for å identifisere bakterier?
Molekylærgenetikken har tilført mikrobiologifaget en rekke metoder som er anvendelige både til kvalitativ og kvantitativ påvisning, og til typing av mikroorgansimer.
Det molekylærgenetiske prinsippet som først kom til anvendelse i forskning og klinisk diagnostikk var bruk av DNA-prober f.eks. for varmelabilt og varmestabilt toksin hos enterotoksigen E. coli. Prinsippet med bruk av hybridiseringsprober er senere og blir fortsatt benyttetet i mange ulike metoder.
Det neste store gjennombruddet kom med utviklingen av PCR-metoden. Da metoden ble viderutviklet på 1990-tallet til real-time eller sanntids PCR, fikk man virkelig en metode var anvendelig i det mikrobiologiske laboratoriet.
I tillegg ble det utviklet mange ulike varianter av PCR-metoden. Ekspempler på dette er broadrange-PCR og kvantitativ PCR.
I dag finnes det også et stort utvalg av metoder for typing av miroorganismer. Disse baserer seg på flere ulike prinsipper, som bruk av restriksjonsenzymer, PCR, og sekvensering.
Hva er DNA hybridisering?
En av de første molekylære metoder benyttet i mikrobiologisk påvisning av bruk av DNA-hybridiseringsprober. Radioaktivt merkede DNA fragmenter fra bakterie eller virus-genom ble brukt til identifisering av ukjente mikroorganismer og til direkte påvisning av mikroorganismer i prøveemateriale.
På bildet ser vi resulatet av hybridisering av HPV-spesifikke promer mot cervixprøve.
Celler som inneholder HPV farges rosa, mens andre celler er blå.
Hva er PCR?
Primært
PCR-metoden representerte et stort skritt framover for molekylgenetiske metoder. Det geniale med metoden er at man med enkle reagenser kan kopiere reaksjoner som skjer i levende celler.
PCR består av 3 Tp-trinn, varmedenaturering av DNA, annealing av korte DNA tåder designet for å binde seg spesifikt til en korresponderende DNA sekvens for eksempel hos en mikroorgansime, og ekstensjon hvor DNA polymerase binder seg til 3-enden av primerne og syntetiserer nytt DNA langs DNA tråden, slik vi ser i på denne illustasjonen.
Hvordan påviser man PCR produkter?
Den mest brukte metoden til påvisning av PCR-produkter fra konvensjonell PCR er gelelektroforese hvor farging av gelen med ethidiumbromid.
Dette stoffet som fluorescerer i UV-lys bindes til dobbelttrådet DNA: Dermed kan en visualisere PCR-fragmenter i gelen.
Lokaliseringen av fragmentet i gelen gir informasjon om størrelsen av fragmentet.
Hva er realtime PCR?
Måler frigjort fluorosens.
Utviklingen av PCR-metoden til real-time format var et viktig steg framover for anvendeligheten av metoden i rutinediagnostikk. De viktigste endringene bestod i at amplifikasjon og deteksjon nå kunne gjøres i ett mot tidligere to trinn. Til dette benyttes merking med fluorescerende molekyler. Et eksempel på en slik metodikk ses på figuren.
På denne måten kan analysen gjøres i løpet av mindre enn en time, betydelig raskere enn med konvensjonell PCR og er dessuten mindre arbeidskrevende.
Faren for kontaminasjon i laboratoriet blir også redusert fordi en ikke lenger behøver å åpne prøverør med PCR-produkt.
Hva er fordelene med PCR diagnostikk?
Hvilken metode brukes ved DNA-sekvensering?
Nevn to typingsmetoder?
Bakteriediagnostikk
En 17 år gammel kvinne innlegges med mistanke om bakteriell meningitt.
Det gjørs spinalfunksjon og lages gramfarget preparat av spinalvæsken (bilde 1).
Ved dyrkning neste dag ses vekst av bakterier på blodagar (bilde 2)
Hvilken bakterie er det?
Den bakteriarten som er mest sannsynlig i dette tilfellet er Streptococcus pneumoniae:
Klinikk og mikrobiologiske funn passer med S.pneumonia, som er en av de vanligste årsakene til bakteriell meningitt.
Karakteristisk for denne bakterien er at den ses som grampositive diplokokker i grampreparatet, og at den danner alfa- (grønn) hemolyse på blodagar.
Det ses også en tydelig “halo” rundt bakteriene som tegn på at de har polysakkaridkapsel, noe som er typisk for pneumokokker.
Det ses også nøytrofile leukocytter i preparatet.
Det er ikke…
E.coli er en gramnegativ stavbakterie, vokser på blodagar, ofte med betahemolyse.
S.aureus er en grampositiv kokk som ses i hauger/drueklaser i grampreparatet, som vokser på blodagar, enten uten hemolyse eller med betahemolyse.
Sjelden årsak til bakteriell meningitt.
Psedumonas aeruginosa er en gramnegativ stavbakterie, vokser på blodagar- av og til med skinnende grønnaktive kolonier, meget uvanlig årsak til meningitt.
