Diagnostik og systematik

Question 1

Typning

Answer 1

Definition: enhver karakterisering under (sub) species niveau.
Metoder anvendt hertil er typningsmetoder som;
Komparativ (kuns ammenlinging inden for samme undersøgelse af mange DNA profiler)
Definitiv (sammenligning til tidligere undersøgelser uden mange kontroller (serotype, fagtype, resistensprofil, DNA sekvens, DNA profiler, PCR af virulensgener))

Typing anvendes til Smitte Eftersporing, løbende overvågning, forudsige virulens og forudsige behandlingsproblemer

Question 2

Principper for a. udbrudseftersporing (smitteeftersporing)
og b. løbende overvågning

Answer 2

a.Over kort tid vil identiske bakterier komme fra samme sted. Sammenlignes der bakterier over lang tid, må de komme fra samme sted, men genetic diversity øges.
Eks: hvis sygdommen er tilbagevenden over lang tid må stedet være ens for smitten og bakteriene kan eks findes i samme kantine.

b. Løbende overvågning
Konstant systematisk kollektion og analyse af data og information der ledes til aktion tager for at forebygge og kontrollere sygdom, typisk af infektiøs natur.
Definition af åberbosning: regelmæssig typing af bakterier isoleret fra løbende udtagning af prøver fra risikoprodukter af dyr hvor typisk resultater bruges til at træffe beslutninger om risikohåndtering.
Incidens er antal tilfælde

Question 3

Hvordan forudsiges virulens?

Answer 3

Virulensgener/produkter m. PCR, serotyping mv.
Formål at forusige behandlingsproblemer til antibiotikaresistens (Fænotyper), resistensgener (PCR og DNA sekvens).
Måling af resistens via disk diffusion (resistense bakterier gror tæt ind til disk med antibiotika).

Question 4

mest alm fænotypsike og genotypiske diagnostisek metoder

Answer 4

Fænotypiske
Serotype (antistoffer)
Fagtype (virusfølsomhed)
Antibiotika resistens
Proteinprofiler
Genotypiske
DNA fingerprints
Pulsefield geler
PCR baserede typinger
DNA sekvens
SNP analyse

Question 5

Serotype

Answer 5

En serotype refererer til en bestemt variant eller undergruppe af en mikroorganisme, såsom bakterier eller virus, der kan identificeres ved karakteristiske antigener. Serotyper defineres typisk ved forskelle i overfladeantigener, såsom proteiner, kulhydrater eller andre molekyler, der er specifikke for en given type eller stamme af mikroorganismer.

For eksempel, når det kommer til bakterier som Salmonella eller Escherichia coli, er deres serotyper ofte bestemt ud fra kombinationen af O-antigener og H-antigener. O-antigener refererer til antigener på bakteriens ydre membran, mens H-antigener er forbundet med bakteriens flageller.

Serotyper spiller en vigtig rolle inden for mikrobiologi og epidemiologi. Identifikationen og karakteriseringen af forskellige serotyper er afgørende for at forstå patogenicitet, sygdomsudbrud og spredning af infektioner. Det er også væsentligt for at udvikle vacciner, da vacciner ofte retter sig mod specifikke serotyper af mikroorganismer.

Serotyping kan udføres ved hjælp af en række metoder, herunder serologiske tests, hvor antistoffer reagerer med de specifikke antigener, eller molekylærbiologiske metoder som PCR (polymerasekædereaktion) eller sekventering, der analyserer gener eller genomregioner, der koder for antigenerne.

Question 6

Beskriv kort lidt om serotyping idag

Answer 6

Serotype
Serotype ved agglutination (kryds bindende antistoffer i typingsserum får, der er positive til at klumpe sammen)
Fagtyping: ??
Hvilke egenskaber ønsker man sig hos en typing metode
Høj diskriminatorisk evne (mange typer, jævnt fordelt, lav sandsynlighed for at stammer der ikke er relaterede til hinanden falder i samme gruppe).
Stor grad af reproducerbarhed (samme resultat ved gentagne typinger og resultat upåvirket af miljø).
Alle stamer inden for en art kan types
Billig
Nu til dags trend med typing:
Alle typing undersøgelser baseres på DNA.
DNA sekvens tager over gelbaserede profiler
DNA sekvens bruges som mimic af gamle fænotypiske metoder

Question 7

Taksonomiske niveauer, der anvendes hos prokaryoter

Answer 7

Rige: bakterier
Phylum (pseudomonadota)
klasse: gammaproteobacteria
Order: enterobacteriales
Familier: enterobacteriacaee
Genus (slægt): salmonella
Species (art): salmonella enterica
Subspecies (underart): salmonella enterica subsp. enterica

Taksonomi afspejler sekvenslighed/forskel i gener for 16s rRNA (18s hos eukaruoter) og danner grundlag for slægtadskillelse og højere enheder

Question 8

Metoder til klassificering af bakterier

Answer 8

Klassifikation kun baseret på fænotyper er umuligt (opgivet i 1940’erne) og
genotypen har derfor prioritet.
Slægter
Fylogeni baseret på 16S rRNA gensekvens-sammenligning (95 % cutoff)
Fylogeni baseret på alle konserverede gener ud fra genomsammenligning
Arter:
DNA-DNA hybridisering imellem total DNA af forskellige bakteriestammer
Fænotypisk sammenligning af micro-morfologi, fysiology, biokemi, kemotaksonomi
Man skal kunne adskille arter fra hinanden fænotypisk (PCR er fornylig anvendt – det er genotype)

Proteinsyntese Apparatet (ribosomer) er ens i alle levende organismer
Mutationer antages ikke at være under selektivt pres.
Ved hjælp af antagelser af mutaitonafrekvenad kan forskelle tilbagedateres

DNA-DNA hybridisering
Adskillelse af arter hvis større end 70-80% lighed i DNA-DNA hybridisering ml stammer.
DNA-DNA hybridisering udførtes førhen som DNA-DNA smeltekurver. Nu om dage er det en digital analyse af hel-genomsekvenser.

Question 9

Ændringer i navne pga taksonomiske regler må ikke skabe grund til misforståelser i klinisk mikrobiologi.
Eksempler på bakterier der burde hedde det samme iht. taksonomi:

Answer 9

Bacillus antracis, B. thuricensis, B. cereus
Shigella spp. og Escherichia coli
Brucella
Yersia pestis og Y. pseudotuberculosis

Question 10

Regler for navngivning af bakterier

Answer 10

Termer brugt om bakterieisolater:
Isolat: udkommet af at tage enkelt kologni på agarplade og gemme denne
Stamme: velkarakteriseret isol,et gemt med særligt navn så man altid kan gå tilbage og genundersøge stammen. Gemmes ved -80 grader i 15% glycerol.
Klon: bakterieisolater der udviser så mange fænotypiske fællestræk eller stor genetisk lighed at den mest sandsynlige forklarign er at de er af samme ophav.
Artsnavn tilknyttes typestammen
TType stammen er én og kun én stamme fra arten. Stammer er velkarakteriseret
Stammen er deponeret i mindst to stammesamlinger, hvorfra den kan distribueres frit
Typestammen knytter sig til arten, også hvis arten omklassificeres til en anden slægt:
Streptococcus faecalis (type strain ATCC 19433T)
Enterococcus faecalis (type strain ATCC 19433T)

Question 11

Definition af typing

Answer 11

Definition af typing: Karakterisering under (sub-) species niveau. Metoder anvendt hertil er typingsmetoder. Typing kan:
Komparativ: kun sammenligning inden for samme undersøge. mange elektroforese profiler.
Definitiv: sammenligning til tidligere udnersægelse uden fælles kontroller. serotype, fagtype, DNA sekvens, meget standardiserende DNA profiler. DNA sekvens ændres ikke at opbevaring

Question 12

Typing kan enten være fænotypiske el. genotypiske. Disse anvendse til:

Answer 12

Typing anvendes til
Smitteeftersporing / udbrudseftersporing (E1):
Løbende overvågning: Ca regnskab over år af mennesker der har fået _.
Kontrol af behandlingseffektivitet:
Forudsige virulens:
Forudsige behandlingsproblemer:
Typings metoder kan være:
Fænotypiske:
Serotype (antistoffer), fagtype (virusfølsomhed, anvendes sjældent), antibiotika resistens, proteinprofiler
Genotypiske:
DNA profiler, DNA sekvens, SNP analyse

Question 13

Kardinalpunkter for typing:

Answer 13

Sekvens giver mulighed for at prædiktere: Serotype, resistens, virulens, sekvenstype (MLST et udvalgt antal gener, cMLST alle gener i core genom, SNP type)

Kardinalpunkter for typing:
* Diskriminatorisk evne: antal typer, fordeling af isolat inden for typer (200 typer er intet værd hvis 98% af isolater falder i samme gruppe). Man har en matematisk index til at bestemme dette (Hunters index).
* Reproducerbarhed: SAmme resultat ved gentagelse. Type stabil ved passage af flere værter.
* Typebarhed: Alle isolater skal kunne types, det gælder eks ikke serotype hvor man har NT non typeable. Alle isolater kan sekventeres.
* Gerne billig

Question 14

DNA sekventering af bakterier har hjulpet os med at afgøre om kvægbesætninger, der bliver ved med at være Salmonella positive er vedvarende inficeret med samme bakteriestamme eller geninficeres med nye stammer, f.eks. i forbindelse med at stæreflokkene ankommer til besætningen hvert år. Hvilken glæde har man af den information?

Answer 14

Forebyggelse.
DNA-sekventering af Salmonella i kvægbesætninger hjælper med at identificere bakteriestammer, spore infektionskilder, overvåge epidemiologiske mønstre, udvikle målrettede interventioner, implementere forebyggelsesforanstaltninger og forbedre dyresundheden.

Question 15

Traditionel diagnostik versus hurtigmetoder

Answer 15

Traditionel diagnostik: Primær dyrkning på rent medie, rendyrkning, slægtsdiagnose, artsdiagnose, typing

Klassisk approach:
Fordele:
Isolat i hånden. Ultimative bevis på tilstedeværelse. Typing muligt. Alternativ diagnose mulig
Ulemper:
Dyrt og langsomt

Hurtigmetoder:
Fordele:
Hastighed, pris, automatisering
Ulemper:
Kun svar på det man spørger om. Ingen koloni

Question 16

Nævn accetable tider ude i feltet

Answer 16

Acceptable tider i diagnostik afhænger af formål og situation:
Reference lab: mindre end en uge
Små diagnostiske lab: 2 dage
Inclinic metoder: mindre end en time
On site / Bed side metoder: 5-10 min.
Online/HACCP metoder: 1-2 min.
Sortin (atline metoder) få sekunder
Idag dyrkes bakteiren på blodager, og bakteiren skrabes af på glas og undersøges af maskine der bestråler den med laser så molekylerne flyver gennem massespektrometer der har database med mange batkerier = billedgenkendelse.

Question 17

PCR princippet

Answer 17

PCR bruges til retsmedicinske analyser, identificerer gammelt DNA og lave artsbestemmelser ved opformering af DNA.PCR (Polymerase Chain Reaction) er en teknik, der anvendes til at producere store mængder af specifik DNA-sekvens fra en lille mængde DNA. Principperne i PCR er som følger:
1) Denaturering: DNA-sekvensen, som skal forstærkes, opvarmes ved en høj temperatur (typisk 95 °C), hvilket bryder hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge og skaber en enkeltstrenget DNA-molekyle.
2) Annealing: Temperaturen sænkes til omkring 55-65 °C, således at de to specifikke oligonukleotidprimer (korte stykker af DNA) kan binde sig til de to ender af den enkeltstrengede DNA-molekyle ved hjælp af hydrogenbindinger. Primerne bestemmer, hvilken specifik sekvens af DNA, der skal forstærkes.
3) Udvidelse: Temperaturen hæves til omkring 72 °C, som er den optimale temperatur for DNA-polymerase, et enzym, der kan syntetisere den manglende DNA-streng ved at bruge de frie nukleotider som byggesten. Polymerasen starter fra primeren og kopierer DNA-sekvensen i 5’ til 3’-retning.
Gentagelse: Trin 1 til 3 gentages i cyklus, så der bliver flere og flere kopier af den specifikke DNA-sekvens.
Ved hver cyklus fordobles mængden af DNA, således at antallet af kopier stiger eksponentielt. Den endelige produkt af PCR er en stor mængde af specifik DNA-sekvens, som kan bruges til forskellige formål, såsom sekventering af DNA, kloning af gener, diagnostik af sygdomme og forskning af genetik og evolution. PCR er en meget følsom teknik og kan detektere meget små mængder af DNA.

Question 18

qPCR princippet

Answer 18

qPCR, også kendt som kvantitativ PCR, anvendes til at måle mængden af en bestemt mRNA i en vævsprøve. Først omdannes mRNA til cDNA, som er mere stabilt og lettere at arbejde med. Derefter udføres PCR på det ønskede gen ved at måle mængden af det øgede produkt i hver cyklus. Hvis genet er stærkt udtrykt, vil der være meget cDNA, og produktmængden vil stige hurtigt. Hvis genet er lavt udtrykt, vil der være mindre cDNA, og produktmængden vil stige langsommere.
For at detektere PCR-produktet skal primerne binde sig til cDNA-molekylet, og der tilsættes et stof, der bindes til dobbeltstrenget DNA og danner et fluorescerende stof, som lyser ved UV-laser. qPCR-kurverne styrer temperaturen og registrerer fluorescensniveauet. Hvis kurven er eksponentiel, er der meget genom af det specifikke gen, mens der i lavt udtrykte gener er en langsommere kurve. Ct-værdien er det antal cyklusser, der skal til, før niveauet af genet når tærskelværdien.
qPCR er velegnet til at sammenligne udtryk af et gen i forskellige væv og hos forskellige patientgrupper, for eksempel for at undersøge mutationer i regulerende sekvenser og genets funktion. Det er mere præcist end en mikroarray, da det kun måler udtryk af et eller få gener.

Question 19

SNAP test (elisa)

Answer 19

HIV-antigen fyldes i alle brøndene, da HIV-antigen vil binde sig til HIV-antistoffer fra det humane serum, som bindes, hvis det er til stede. Et sekundært antistof fra f.eks. en kanin tilsættes derefter,
som vil binde sig med antistoffet mod HIV, hvis antistoffet er til stede. Det sekundære antistof har et enzym bundet, som farves hvis det sekundære antistof binder sig til HIV antistof. Dette sker fordi at enzymets substrat tilføres. Dermed vil enzymet gå i gang med at katalyserer en proces, som resulterer i et farvet produkt. Derfor kan vi ved at aflæse prøverne og deres farve finde ud af
om der er HIV antistoffer i det humane serum.

Positiv kontrol: Vi bruger en positiv kontrol til at fremsige, hvordan resultatet burde se ud. Hvis man ikke brugte positive kontrol ville det give problemer. Dette er fordi der eventuelt var mulighed for at der har været fejlkilder indblandet. Og disse fejlkilder kan give forkerte resultater. I den positive kontrol kunne der forekomme antistof, som passer til antigenet.

Negativ kontrol: Den negative kontrol bruges for at vise, hvordan en person uden antigener vil reagere. I den negative kunne der blive brugt demineraliseret vand.

Question 20

FOrklar princippet i ELISA

Answer 20

Snap-testen, også kendt som ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), er en diagnostisk metode, der identificerer specifikke proteiner eller antistoffer i prøver. Antigener immobiliseres på en overflade, og efter blokering og vask bindes prøvernes antigen eller antistof til de immobiliserede molekyler. Et enzym-konjugat tilføjes, og substratet omdannes til et målbart signal, som måles for at indikere tilstedeværelsen af det specifikke molekyle. Snap-testen er en hurtig og enkel anvendelse af ELISA og bruges ofte i felt- eller veterinærmedicinske situationer, hvor øjeblikkelig diagnostisk information er afgørende.

Question 21

Flere typer af elisa test

Answer 21

Indirekte ELISA: Identificerer antistoffer i en prøve ved at måle, hvor godt de binder sig til et kendt antigen.
Direkte ELISA: Detekterer selve antigenet i prøven ved at måle bindingen til et specifikt antistof.
Sandwich ELISA: Bruger to antistoffer, hvor det ene binder sig til antigenet i prøven, mens det andet fanger det mellem sig, hvilket muliggør påvisning af antigenet.
Konkurrence ELISA: Anvendes til at konkurrere om binding til et fastlagt antigen mellem prøven og et mærket antistof for at bestemme mængden af antigen i prøven.
_______________________________
Der findes flere forskellige ELISA teknikker, men der skelnes generelt mellem direkte og in-direkte ELISA
afhængigt af hvor enzymet er placeret i forhold til det stof man ønsker at måle på. Ved direkte ELISA er enzymet konjugeret til det primære antistof, der binder direkte til antigenet, hvorimod ved in-direkte ELISA er enzymet konjugeret til det sekundære antistof som binder til det primære antistof.
Direkte ELISA: Enzym konjugeret til primært antistof der binder til antigen på pladen
Indirekte ELISA: Enzym er konjugeret til sekundært antistof, der bindes til primært antistof, som bindes til antigen på pladen.

Ønsker man i stedet at måle antigener anvendes enten sandwich ELISA eller kompetitiv ELISA.
I sandwich ELISA absorberes et antistof rettet mod antigenet til plastoverfladen. Overskydende sites blokeres og prøven med antigen tilsættes. Ikke bundet materiale vaskes væk. Dernæst tilsættes et andet antistof rettet mod antigenet, og derpå et sekundært antistof der har enzym bundet.
::::::::::::::::::::::::::::::::
Konkurrence elisa:
Kigger på farve
i prøve har vi både serumantigen og antistoffer - vi har et referecen antigen i en brønd og hælper antigen-antistof end til refereenceantigen - nu vasker vi og der er kun frie antistoffer tilabge - er der mange frie antistofer tilabge bindes sekundært antistof + enzym = meget farve = meget lidt antigen i prøven!
Er der lys fare er der mange antistoffer der er bundet til antigen go vasket væk

Question 22

PRincip elisa

Answer 22

ELISA test bestemmer forekomst af specifikke antistoffer i blod. ELISA er heterogen immunoassays (reaktanter er i to faser; fast fase). Via passiv adsorption fastholdes proteiner og immobiliseres på overfladen af plastik. Adsorption kan fremmes ved specifikke koncentrationer og buffere med ph 8-10. Primær interaktion skyldes ladningsforhold og bidning med hydrofobe kræfter.
OBS: nogle antigener/stoffer denatureres under adsorptionen. Visualisering af ELISA via enzymkonjugeret antistof med substrat der flourisere/skifter farve ved enzymatisk reaktion og tilstedeværelse af antistof. Måles i spektrofotometer. Direkte ELISA: Enzym konjugeret til primært antistof der binder til antigen på pladen
Indirekte ELISA: Enzym er konjugeret til sekundært antistof, der bindes til primært antistof, som bindes til antigen på pladen.
Antigen immobiliseres til plade. Overskydenden bindingsites blokeres med bovint serumalbumun BSA/detergent.
Vask og tilsæt fortynding af serum (der undersøges for antistoffer)
Vask. Tilsæt sekundært enzym mærket antistof (som bindes specifikt til primært antistof).
Vask. Tilsæt kromogent substrat og aflæs i spektrofotometer.
Sandwich ELISA: absorberes antistof rettet mod antigen på plast. Capture antistof - antigen - primært antistof - sekundært antistof konjugat - enzym
Kompetitiv ELISA: antigen i prøven konkurrere med antigen i pladen.