cours8 Flashcards
1
Q
pourquoi faire de la microscopie
A
Œil: résolution de 0.1mm !
2
Q
principe de la microscopie
A
- Former une image de l’objet grâce à des photons ou électrons
- Agrandir cette image grâce à des lentilles
3
Q
techniques de microscopie optique
A
à transmission = fond clair et contraste de phage
à émission = champs large et confocal
4
Q
techniques de microscopie électrique
A
à émission et à balayage
5
Q
anatomie du microscope optique composé
A
- Avec le meilleur équipement :
- Grossissement jusqu’à 2000X
- Résolution de 100 nm
6
Q
types de microscopie composés
A
droit
inversé ($)
stéréo microscope
7
Q
microscopie en fond clair
A
- Configuration simple et peu couteux
- La lumière traverse l’échantillon, qui apparaît
foncé sur un fond clair - Pour spécimens colorés ou ayant bon
contraste naturel - Peu de contraste si le spécimen est transparent…
8
Q
microscopie en fond noir
A
- Idéal pour augmenter le contraste des
échantillons transparents ou peu contrastés - Illumination oblique de l’échantillon
(condenseur à fond sombre) - Seuls les rayons diffractés par l’échantillon
atteignent l’objectif - L’échantillon apparaît clair sur un fond sombre
9
Q
microscopie à contraste de phase
A
- Permet de visualiser les structures
transparentes avec un indice de réfraction
qui diffère de celui de leur voisinage - Change les différences de phase en
contraste (intensité lumineuse) - Lumière qui passe au travers d’une structure
= déphasage par rapport aux autres rayons - Idéal pour spécimens vivants offrant peu de contraste et difficilement visibles en champ clair
- Mal adapté aux échantillons colorés
10
Q
anneaux de phase
A
dans le condenseur et dans
l’objectif qui filtrent les rayons déphasés et
convertissent en différence d’intensité lumineuse(tons de gris)
* Améliore la visibilité des structures comme noyau, membranes, organites, etc.
11
Q
microscopie à contraste interférentiel (DIC)
A
- Utilise la polarisation et la séparation de la lumière afin de produire une image en relief, effet quasi-3D
- Les faisceaux traversent l’échantillon avec des angles différents et réagissent différemment selon indice de réfraction et géométrie des structures (déphasage)
- Les faisceaux sont recombinés ensemble et la
différence de phase crée des zones d’interférences - contrastes nets qui accentuent les reliefs
- Composantes optiques supplémentaires (prismes et filtres polarisants) = $$$
- Idéal pour spécimens vivants offrant peu de contraste et donc difficilement visibles en champ clair
- Souvent mal adapté aux échantillons épais ou colorés
12
Q
préparation des spécimens
A
- Il existe pratiquement autant de techniques que de types d’échantillons à observer
- Technique la plus simple: montage humide frais
13
Q
montage humide frais
A
- Idéal pour observer les cellules vivantes
(ex: fond clair, contraste de phase) - Aucune préservation du spécimen
- Certaines cellules ne possèdent pas
suffisamment de contraste naturel - Non-adapté pour les tissus épais et complexes
(idéalement 1 ou 2 couches de cellules)
14
Q
Que faire pour augmenter le contraste du spécimen?
A
- Microscopie à fond noir, contraste de phase ou fluorescence
- Colorants spécifiques qui ciblent certaines structures/molécules
- Ex: coloration Gram (crystal violet et safranine), vert de malachite, encre de Chine
- Ex: Hématoxyline éosine (HE), Verhoeff, Giemsa, Herlant, PAS, HPO…
15
Q
Que faire si on veut préserver le spécimen dans son état actuel?
A
- Fixation par la chaleur (ex: coloration Gram)
- Fixe l’échantillon à la lame et empêche le mouvement, métabolisme et la décomposition du spécimen
- Rapide et simple, mais peut altérer structures cellulaires, dénaturation des protéines et épitopes
- Surtout utilisée pour visualiser les microorganismes en fond clair
16
Q
fixation chimique
A
- Protège le spécimen en empêchant ça dégradation, stabilise les structures cellulaires et arrête les processus biologiques
- Certains fixateurs peuvent aider ou nuire à la coloration ultérieure
17
Q
exemples de fixateurs
A
§ Formaldéhyde
§ Glutaraldéhyde
§ Éthanol/méthanol (dénature les protéines!)
18
Q
préparation pour les coupes histologiques
A
on procède ensuite habituellement à l’infiltration dans de la paraffine
- Augmente la rigidité du tissu pour coupes minces
- Fixation chimique, déshydratation et infiltration
- Coupes minces de 3-5 μm, ensuite coloration
1. fixation
2. déhydratation
3. clearing
4. infiltration
5. embedding
19
Q
préservation des lamelles
A
généralement on le fige ensuite dans une résine durcissant (milieu de montage)
- Protège les spécimens contre l’évaporation
- Empêche leur dégradation à long terme (humidité, oxygène, bleaching, etc.)
- Améliore la résolution optique (interface de réfraction plus uniforme
20
Q
microscopie à fluorescence
A
- Permet d’observer l’émission de lumière des molécules fluorescentes se nommant fluorophores
- Produit des images sur fond noir où seulement les fluorophores sont visibles
- Les échantillons doivent presque toujours être préalablement colorés avec un ou des fluorophores (sauf protéines fluo)
21
Q
application microscopie à fluorescence
A
- Détection de cellules spécifiques (vivantes, mortes, apoptotiques, types cellulaires différents)
- Détection de structures cellulaires (noyaux, membranes, mitochondries, cytosquelette)
- Détection de molécules spécifiques, souvent des protéines ou des acides nucléiques
- Détection de certaines réactions (oxydation, activité métabolique)
22
Q
les fluorophores
A
- pls possibilités
- beaucoup de fluorophores sont toxiques ou trop gros pour passer la membrane plasmique (nécessitent perméabilisation des cellules)
23
Q
fluorophores réactifs
A
- Utilisés directement comme réactif et ciblent des structures ou réactions métaboliques spécifiques (DAPI, Hoechst, Calcein AM, MitoTracker Orange…)
24
Q
fluorophores conjugués
A
Ne ciblent aucune structure particulière mais sont conjugués à d’autres molécules qui eux cibleront les structures désirées (FITC, TRITC, Texas Red, Alexa Fluor, Cyanine 3…)
25
protéines fluorescentes
Protéines naturellement fluorescentes (GFP, RFP, YFP...)
26
visualisation de la morphologie cellulaires
* Bleu : noyaux colorés au Hoechst
* Jaune : membranes plasmiques colorées au DiI (lipide fluorescent)
27
détection des cellules mortes
* Bleu : noyaux colorés au Hoechst
* Rose : cellules mortes colorées à l’iodure de propidium (PI)
28
détection direct immunofluorescence
technique rapide et moins complexe
possibilité d'utiliser simultanément des anticorps produits dans une même espèce
technique moins sensible
difficulté de trouver des anticorps primaires conjugués (surtout avec fluorophore désiré)
29
détection indirecte immunofluorescence
plus grande sensibilité
anticorps secondaires conjugués facilement disponibles avec une grande variété de fluorophores
anticorps primaires utilisés doivent être d'espèces ou d'isotopes différents
anticorps secondaires peuvent produire un bruit de fond en se liant à certains anticorps pouvant se trouver dans les tissus
30
visualisation des microtubules
* Bleu : noyau coloré au DAPI
* Vert : α-tubuline colorée avec un
anticorps anti-α-tubuline conjugué à
Alexa Fluor 488 (primaire)
* Cellules préalablement fixées et
perméabilisées
31
détection de dommage à l'adn
* Bleu : noyaux colorés au DAPI
* Rouge : sites de dommage à l’ADN détectés avec un anticorps anti-gamma-H2AX phosphorylé et un anticorps secondaire
conjugué au fluorophore Alexa Fluor 594
* Cellules préalablement fixées et perméabilisées
32
fluorophores conjugués à un acide nucléique (FISH)
détection par un acide nucléique = FISH
cible et détecte une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN
pour la détection de loci dans un génome ou pour vérifier la présence de certains ARN dans une cellule
cellules fixées et perméabilisées avant
33
Détection des télomères sur des chromosomes
* Bleu = coloration de l’ADN au DAPI
* Rouge = détection des télomères avec une
sonde d’ADN conjuguée à la cyanine 3 (Cy3)
34
détection ARNm spécifique
* Bleu = coloration des noyaux au DAPI
* Rouge = détection de l’ARNm de la
beta-actine avec une sonde couplée à la cyanine 3
* Vert = cytoplasme coloré avec la protéine fluorescente verte (GFP)
35
protéines fluorescentes
* Pas besoin de colorer ou fixer/perméabiliser les cellules !
* Non-toxiques, permet de visualiser les cellules vivantes
- Microscopie à fluorescence en temps réel
36
exemple de protéines fluorescentes
Fusion avec Histone H2B permettant de visualiser la chromatine en temps réel
37
Microscopie à épifluorescence
l’échantillon est illuminé en entier, et la lumière au focus et hors-focus est captée
38
microscopie confocale
utilisation de lasers et filtres optiques pour capter seulement la lumière au focus (sections/couches optiques)
39
avantages microscopie à épifluorescence
- Temps d’acquisition rapide
- Simple d’utilisation
- Appareils plus abordables (20 000$ à 150 000$)
40
désavantages microscopie à épifluorescence
- Contamination par la lumière hors focus
- Ne permet pas la reconstruction 3D
41
utilisation microscopie à épifluorescence
- Coupe mince de tissu (épaisseur d’environ 5 μm)
- Caractérisation grossière de cellules
42
avantages microscopie confocale
- Permet d’éliminer la lumière hors focus
- Images composées de sections optiques minces
- Bruit de fond réduit
43
désavantages microscopie confocale
- Temps d’acquisition beaucoup plus long
- Appareils dispendieux (200 000$ et +)
44
utilisation microscopie confocale
- Échantillons avec beaucoup d’autofluorescence
- Reconstruction 3D
45
microscopie électronique
* Utilise un faisceau d’électrons au lieu d’un faisceau de photons
* Appareils très dispendieux (100K-1000K $)
* Préparation des échantillons plus compliquée qu’en microscopie optique
* Ne permet pas de faire l’imagerie d’organismes vivants
46
types de microscopie électronique
* Microscope électronique à transmission
* Microscope électronique à balayage
47
microscopie électronique à transmission (TEM)
* Grossissement de 1 000 000 - 10 000 000X (et plus)
* Résolution de ~0.1 nm
* Le faisceau d’électron traverse une section
d’échantillon ultra-mince (10 à 200 nm d’épaisseur).
* L’absorption des électrons dû à l’épaisseur ou à la composition de l’échantillon forme l’image.
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microscopie électronique à balayage (SEM)
* Le faisceau d’électron balaie la surface de
l’échantillon et donne une image à l’apparence 3D
* Les échantillons biologiques doivent être
préalablement recouvert d’une fine couche de
métal
* Un grossissement de plus de 250 000X peut être atteint avec une résolution d’environ 1 nm
