cours 5 Flashcards
chromatographie partie 2
chromatographie échangeuse d’ions
- Séparation selon la charge nette des composés (+ ou -)
- Phase stationnaire = groupes fonctionnels chargés négativement ou positivement
- Adsorption des solutés par liaisons ioniques (+ ou -) et déplacement des contre-ions
- Les composés de même charge ou de charge neutre (nette) ne
sont pas adsorbés sur la phase stationnaire
élution chromatographie échangeuse d’ions
augmentant concentration en sels ou en
changeant le pH de la phase mobile
élution avec le sel
- compétitionnent pour la phase stationnaire
- neutralisent les charges des composés et protéines
élution avec pH
- Change la charge nette des composés et protéines
(charge des groupements fonctionnels)
point isoélectrique
pH auquel la charge nette d’une molécule (protéine) est nulle
chromatographie liquide haute performance (HPLC)
- Même principe que chromatographie sur colonne classique
- Utilisation de système sophistiqué haute performance ($$$)
- Fortes pressions (vs gravité), séparation rapide, haute résolution
- Détection en temps réel possible
- Compatibles avec autres types chromatographie
injecteur HPLC
volume injecté entre 10 et 100 μl
pompe HPLC
pompe à haute pression (entre 5000-7000 psi)
colonne HPLC
longueur et diamètre différent
chromatographie HPLC
exclusion, adsorption (polarité), hydrophobe, affinité, éch. ions, etc.
phase mobile HPLC
la nature, polarité, force éluante
détecteur HPLC
UV, IR, électrochimie, réfractomètre, MS…
élution HPLC
mode isocratique ou mode gradient
détecteur UV visible UVD
- Mesure l’absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne
- Sensibilité de l’ordre du ng
- Il faut que le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d’onde accessible à l’appareil
- Quantitatif (loi de Beer-Lambert)
- Il est important que la phase mobile n’absorbe pas la lumière à la longueur d’onde choisie
- Polyvalent mais peu spécifique
fluorimètre FLD
- Mesure de la fluorescence émise
- Plus sélectif et sensible que UV-visible (jusqu’au fg)
- L’intensité de la fluorescence est directement proportionnelle à la concentration
- Inconvénient: peu de composés sont naturellement fluorescents…
réfractomètre (RID)
- Mesure la variation de l’indice de réfraction à la sortie de la colonne
- C’est une mesure extrêmement précise mais peu sensible (μg)
- On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure
- Utiliser seulement en mode isocratique
- Sensible aux variations de température
détecteur électrochimique
- Mesure le changement de courant électrique produit par la réduction ou oxydation d’une
substance à une électrode - Limité aux substances oxydables ou réductibles
- Très grande sensibilité (fg)
- L’échantillon est modifié au cours de la mesure (méthode destructive)
spectrométrie de masse (MS)
- Largement utilisée (qualitatif et le quantitatif), surtout en protéomique (HPLC-MS)
- Idéal pour les mélanges complexes et composés inconnus
- Détermine la composition, la structure et la masse moléculaire des solutés
- Grande sensibilité de l’ordre du ng/pg (10-9 à 10-12)
- Méthode puissante mais $$$
- Les composés doivent être ionisables (méthode destructive)
acides aminés ionisables
- Acides et basiques
- Groupes terminaux (NH2 et
COOH) - Possibilité de digérer les
protéines (trypsine,
chymotripsine, etc.)
chromatographie en phase gazeuse (CPG)
- Applicable à des échantillons gazeux ou susceptibles d’être vaporisés (sans se
décomposer) - La phase mobile est un gaz
- Phase stationnaire liquide (non-volatil) ou solide
- Séparation selon solubilité/adsorption avec phase stationnaire + point d’ébullition (volatilité)
- Différents types de détecteur possibles (dont le MS
