cours 3 Flashcards
centrifugation et précipitation
principe de centrifugation
Une particule (cellule, organite, macromolécule…) est soumise à une force quand le tube est
tourné à une certaine vitesse
F = mew2r
RPM
On exprime la vitesse de centrifugation en « RPM »
révolutions par minute
En fonction du modèle de centrifugeuse et du type de rotor utilisé
RCF
La force de centrifugation relative (RCF) en « g »
la force qui s’exerce sur une particule en rotation, peu importe le type de rotor
1 RCF = 1x l’accélération gravitationnelle terrestre (9,81 m/s2)
sédimentation
La résistance du milieu au déplacement de la particule constitue une force de
flottaison (poussée d’Archimède) qui s’oppose à la sédimentation de la particule.
que se passe-t-il sur la sédimentation si la particule est plus dense
Grande vitesse de sédimentation
que se passe-t-il sur la sédimentation lorsque le milieu est plus dense
Petite vitesse de sédimentation
de quoi dépend la vitesse de sédimentation
de la masse ET densité d’une particule
vrai ou faux
La forme d’une particule a aussi un effet
vrai
résistance hydrodynamique
types de centrifugeuses
- Différents rotors (ou non), volumes, vitesses,
- Avec ou sans contrôle de vitesse d’accélération ou de décélération
- Avec ou sans contrôle de température de centrifugation
types de rotors
rotor à angle fixe
rotor à godets oscillants (swinging bucket)
centrifugation différentielle
- Permet de séparer +/- grossièrement les constituants
cellulaires selon leur vitesse de sédimentation - Séparation ou fractionnement d’un homogénat selon
taille (masse), densité et forme - On procède à une série de centrifugation avec des
forces centrifuges croissantes - Surtout utilisée pour la récupération de culots et
l’obtention de préparations partiellement pures
d’organelles et/ou macromolécules
à quoi peut servir la centrifugation différente par exemple
- Possibilité de répéter la
procédure avec un culot
resuspendu dans un tampon
isotonique (nettoyer le culot) - Possibilité de combiner
avec d’autres types de
centrifugation
comment faire pour valider si le culot de la centrifugation différentielle contient les éléments essentiels
validation par les biomarqueurs
centrifugation sur gradient de densité
- Souvent combinée à la centrifugation
différentielle - On dépose notre échantillon sur une certaine
solution possédant un gradient de densité - Gradient discontinu (sur coussin) ou continu
- Méthode la plus utilisée pour la séparation
des organelles et macromolécules - Une seule vitesse de centrifugation vs
centrifugation différentielle
2 catégories de centrifugation sur gradient de densité
centrifugation isopycnique
centrifugation zonale sur gradient
centrifugation isopycnique
- Séparation selon la densité des particules
- La densité de la particule à purifier doit être
entre les limites du gradient - On centrifuge à l’équilibre, chaque particule
se stabilisera à la position à laquelle la densité
du gradient est égale à leur densité - La masse impacte seulement la vitesse de
sédimentation vers la position d’équilibre
exemple de centrifugation isopycnique
purification + mesure de densité,
purification protéines, acides nucléiques,
organelles, types cellulaires, etc.
gradient généré au préalable
on dépose notre échantillon au-dessus du gradient
gradient autogénérés
on mélange notre
échantillon avec la solution gradient
centrifugation zonale sur gradient de densité
- Surtout utilisée pour séparer des particules avec
des densités similaires - Séparation selon taille (masse), les plus lourdes
sédimentent plus rapidement - La densité de la particule à purifier doit être plus
grande que la densité la plus élevé du gradient - On ne centrifuge pas à l’équilibre, le gradient sert à
ralentir la sédimentation (pas trop longtemps!)
exemple centrifugation zonale sur gradient de densité
purification d’anticorps
Centrifugation isopycnique sur gradient continu de ClCs
Une solution ClCs de densité donnée forme
spontanément un gradient de densité continu
lorsque soumise à une force de centrifugation
* La résolution atteint le centième d’unité de densité
* On mélange l’échantillon avec la solution de ClCs
* Les molécules vont se déplacer jusqu’à ce que la
densité du milieu soit égale à leur densité
* On peut ensuite recueillir les différentes fractions
(ADNg, plasmides, ARN, etc.)
Centrifugation zonale sur gradient continu ou discontinu de sucrose
- Gradient de sucrose continu ou discontinu
préformé avant la centrifugation - On dépose notre échantillon sur le gradient
- Les molécules vont sédimenter plus ou moins
rapidement selon leur masse - On peut ensuite recueillir les différentes fractions
principe de précipitation
Réduction de la solubilité de molécules (ADN,
protéines, etc.) via altération des interactions
avec le solvant (eau)
* Changement de pH, sels, ajout de solvants,
température, etc.
* Formation d’un précipité sous forme d’agrégats
en solution
* La sédimentation est accélérée par la
centrifugation
