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principes de méthodologie en biologie > cours 7 > Flashcards

cours 7 Flashcards

techniques immunologiques

1
Q

immunologie

A

étude du système immunitaire
Distinction entre le soi et le non-soi

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Q

Système excessivement complexe chez _

A

les eucaryotes supérieurs

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3
Q

anticorps

A

complexe protéique produit par le système immunitaire adaptatif (mémoire) en réponse à
la présence d’un antigène
Reconnaissance « spécifique » des antigènes
Neutralisation des agents pathogènes

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4
Q

antigène

A

substance (généralement étrangère) qui est reconnue par les anticorps
Microbe, protéine, polysaccharide, lipide…
Naturelle ou synthétique
Capacité de provoquer une réaction immunitaire
(immunogène)

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5
Q

L’ABC d’un anticorps (humain)

A

Structure en Y de 4 chaînes polypeptidiques
Une région variable sur chacun des bras
Une région constante qui comprend la région Fc

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6
Q

Structure en Y de 4 chaînes polypeptidiques

A
  • 2 chaînes lourdes identiques
  • 2 chaînes légères identiques
  • Ponts S-S
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7
Q

Une région variable sur chacun des bras

A
  • 2 sites de liaison de l’antigène (bivalents)
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8
Q

Une région constante qui comprend la région Fc

A
  • liaison aux récepteurs des cellules immunitaires
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9
Q

5 classes anticorps chez l’humain

A

IgM pentameter
IgG monometer
Secretory IgA dimer
IgE monotor
IgD monometer

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10
Q

paratope

A

région de 5-10 acides aminés qui est
responsable de la reconnaissance moléculaire des anticorps
- Région CDR des régions variables

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11
Q

épitope

A

courte région moléculaire (5-6 a.a.) présente sur
les antigènes qui est reconnue par les CDRs

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12
Q

concept clé serrure

A

Liaison = formation d’un complexe Ac-Ag (Ab-Ac)

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13
Q

pourquoi est ce que la sensibilité des essais immunologiques est très élevée

A

L’affinité d’un anticorps pour son antigène est
très élevée
Il y a liaison Ac-Ag même à des concentrations
très faibles

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14
Q

épitope séquentiel

A

portion linéaire d’un antigène reconnue par un anticorps, composée d’une séquence continue d’acides aminés

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15
Q

épitope conformationnel

A

formé par des acides aminés non consécutifs dans la séquence, mais rapprochés dans l’espace grâce au repliement tridimensionnel de la protéine.

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16
Q

Anticorps polyclonaux

A

reconnaissance de différents épitopes (paratopes différents)

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17
Q

Anticorps monoclonaux

A

reconnaissance d’un seul épitope (paratope unique)

18
Q

avantages et inconvénients polyclonaux

A

Population hétérogène produite par différents clones de lymphocytes B (plasma)
Reconnaissance de différents épitopes
Plus grande sensibilité pour la détection de faibles quantités d’antigènes, spécificité moindre
Production rapide (3 mois) et peu couteuse
Variabilité plus grande entre les lots

19
Q

avantages et inconvénients monoclonaux

A

Population homogène produite par un seul clone de lymphocytes B (hybridome)
Reconnaissance d’un seul et même épitope
Spécificité très élevée, moins de chances de réactivité croisée (bruit de fond)
Production plus longue (~6 mois) et plus couteuse
Très haute reproductibilité (lignée cellulaire)

20
Q

purification d’anticorps par chromatographie d’affinité

A

matrice avec antigène lié
simple loading - washing - elution

21
Q

Est-ce possible de détecter seulement une protéine d’intérêt (vs Coomassie) ?

A

oui
Utilisation d’anticorps spécifiques contre notre protéine à révéler
immunobuvardage de type Western

22
Q

immunobuvardage de type Western

A

transfert des protéines sur membrane
ON PEUT UTILISER DIFFÉRENTES TECHNIQUES POUR VISUALISER LA RÉACTION AC-AG
qualitatif ou semi quantitatif

23
Q

étapes immunobuvardage de type Western

A
  1. dyes
  2. transfert
  3. lavage
  4. blocage de la membrane
  5. incubation antigène primaire
  6. lavage
  7. incubation antigène secondaire
  8. lavage
  9. chimiluminescence ou coloration
24
Q

problèmes courants en Western blot

A

absence de bandes
bandes de mauvaises masse moléculaire
bruit de fond élevé

25
absence de bandes
- Trop basse expression de l’antigène, mauvaise localisation cellulaire - Incompatibilité entre anticorps secondaire et primaire - Épitope conformationnel
26
bandes de mauvaises masses moléculaires
- Dégradation par protéases - Modifications post-traductionnelles - Dénaturation insuffisante
27
bruit de fond élevé
- Concentration trop élevée de l’anticorps primaire - Blocage/lavages insuffisant - Réactivité croisée avec d’autre antigènes
28
Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay)
Essai en plaque conçu pour détecter et quantifier anticorps ou antigènes Développé au début des années 70, très utilisé pour le diagnostic desinfections et détection des allergènes Rapide, simple, sensible, et haut-débit (96 ou 384 puits!)
29
variantes ELISA
Direct indirect sandwich compétitif
30
ELISA direct
- Variante la plus simple et la plus rapide - L’anticorps sélectionné doit être conjugué à un système de détection - Bruit de fond parfois plus important en raison de l’immobilisation non-spécifique de l’antigène 1. fixation antigène 2. lavage + blocage 3. anticorps primaire 4. lavage + blocage 5. mesure du signal
31
ELISA indirect
- Utilisation d’un anticorps primaire et un anticorps secondaire - Plus grande flexibilité que l’ELISA direct (anticorps primaire non-conjugué) mais un peu plus long - Meilleure sensibilité car liaison de >1 anticorps secondaire par anticorps primaire (amplification) - Comme ELISA direct, immobilisation non-spécifique de l’antigène (bruit de fond) 1. fixation antigène 2. lavage + blocage 3. anticorps primaire 4. lavage + blocage 5. anticorps secondaire 6. lavage + blocage 7. mesure du signal
32
ELISA sandwich
- Capture spécifique de l’antigène via anticorps primaire immobilisé à la surface des puits - Anticorps secondaire qui reconnait un épitope distinct (sinon quoi?) = sandwich - Parfait pour détecter antigènes dans mélanges complexes (2-5 fois plus sensible) - Détection directe ou indirecte (amplification signal) 1. anticorps primaire 2. lavage + blocage 3. capture de l'antigène 4. lavage + blocage 5. anticorps secondaire 6. lavage + blocage 7. mesure du signal
33
ELISA quantitatif et optimisation
standard samples blanc
34
purification d'antigène par immunoprécipitation
1) Ajout de l’anticorps au mélange 2) Formation du complexe Ac-Ag 3) Ajout de billes liant le fragment Fc (protéine A ou G) 4) Centrifugation douce, retrait du surnageant, lavage 5) Élution, centrifugation finale, récupération du surnageant Affinité des protéines A et G (lien)
35
Billes agarose vs billes magnétiques
addition des billes magnétiques bondage spécifique supernatant removal lavage et élution
36
exemples d'application de la précipitation d'antigène par immunoprécipitation
- Immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage haut-débit (ChIP-seq) - Permet l’identification des sites de liaison de protéines liant l’ADN
37
les réactions d'agglutination
Antigènes solubles = immunoprécipitation * Antigènes à la surface de particules = formation d’agrégats (agglutination) - Seulement à concentration optimale
38
exemples d'application d'agglutination
- Ex: Identification de streptocoques du groupe A (pharyngite et scarlatine) - Rapide et simple, mais beaucoup moins sensible que l’ELISA
39
les anticorps recombinants
* Variants d’anticorps naturels - Fragments synthétiques - Chimères - Multivalence * Univers pratiquement infini de possibilités
40
phage-display
usine à découverte de bio thérapeutique

principes de méthodologie en biologie (9 decks)

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