cours 2 Flashcards
extraction et filtration
1
Q
pour quels types de composés est ce que la majorité des projets de recherche en biologie nécessitent l’extraction, l’enrichissement
ou la purification
A
Organelles, membranes, protéines, ARN/ADN, métabolites, ions
2
Q
quels types de composés purifiés est ce qu’on va pouvoir analyser
A
Quantité/pureté, structure, poids moléculaire, activité enzymatique, partenaires, etc
3
Q
vrai ou faux
la purification nécessite souvent une seule étape
A
faux
Chaque étape vise à éliminer une classe de « contaminants
4
Q
quelle est la première étape de la purification
A
lyser les cellules pour
libérer leur contenu dans un tampon de lyse (extraction)
5
Q
caractéristiques des techniques d’extraction
A
- À adapter selon type de matériel (organe, tissus, cellules…)
- Cellules animales, levures, bactéries?
- Volume à extraire, et nature de ce que l’on veut purifier
- Souvent une combinaison de traitements mécaniques,
chimiques et enzymatiques
6
Q
extraction des cellules en suspension
A
centrifugation à basse vitesse
7
Q
extraction des cellules adhérentes
A
trypsinisation suivie d’une centrifugation
8
Q
méthodes d’extraction des tissus
A
- Souvent un 1er traitement grossier sans tampon
- Traitements suivants dans un tampon de lyse (morceaux)
9
Q
mortier et pilon
A
- Surtout utilisé comme pré-traitement pour les tissus rigides (végétaux, os, cartilage…)
- Souvent combiné à l’azote liquide pour faciliter le broyage des tissus (à sec)
- Peu couteux, mais lent
- Doit être combiné à d’autres méthodes pour arriver à une lyse efficace des cellules
10
Q
mélangeur (Waring blender)
A
- Lames rotatives à haute vitesse
- Surtout utilisé pour le prétraitement des tissus animaux ou végétaux durs
(grossier) - Idéal pour les grands volumes, non-adapté aux petits volumes
- Peu couteux
- Attention à la chaleur !
11
Q
homogénisateur de type rotor-stator
A
- Très grande variété de modèles, rapide et efficace, homogénat uniforme
- Idéal pour les tissus mous, grande étendue de volumes (mais $$)
- Possibilité de lyser les cellules sans briser les organelles
- Attention à la chaleur (possibilité de travailler sur glace)
12
Q
Homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem
A
- Piston ajusté dans un tube de verre, surtout cellules eucaryotes et tissus mous
- Parfois automatisé (Potter), adaptés pour les faibles volumes
- Idéal pour lyser les cellules sans briser les organelles (noyaux, mitochondries…)
- Ne convient pas aux bactéries et levures avec parois rigides
13
Q
Homogénéisateur à billes (bead beater)
A
- Surtout pour cellules en suspension et faibles volumes
- Efficace pour pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
- Souvent en combinaison avec méthodes chimiques
- Attention à la chaleur !
14
Q
Homogénéisateur à haute pression
A
- Très efficace pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
- Non adapté pour les grands volumes
- Appareil dispendieux ($$$)
- Limité aux suspensions de cellules (surtout m-o)
- Sensible aux agglomérats
15
Q
sonication
A
- Ultrasons créant des forces de cavitation (Attention à la chaleur !
- Très efficace pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
- Limité aux suspensions de cellules (inefficace pour morceaux de tissus)
- Homogénat très uniforme
- Brise les organites cellulaires
- Peut fragmenter l’ADN
16
Q
Traitements enzymatiques pour briser la MEC des tissus
A
- Enzymes comme la collagénase, trypsine, pectinase, etc.
- Très pratique pour isoler des cellules intactes
- Pré-traitement dans un tampon adapté
- Parfois en combinaison à d’autres techniques pour lyse complète des cellules
17
Q
Traitements enzymatiques pour fragiliser les parois
A
- Pour les cellules difficiles à lyser, il est possible
d’utiliser des enzymes pour dégrader la paroi - Lysosyme, zymolyase, cellulase, etc.
- Prétraitement dans un tampon adapté
- Souvent en combinaison avec lyse douce (détergents non-ioniques, sonication…)
18
Q
choc osmotique
A
- Pour cellules animales
- Solution hypotonique = cytolyse
- Solution hypertonique = plasmolyse
19
Q
Utilisation de détergents (surfactants)
A
- Composé amphiphile
- Ioniques ou non-ioniques
- S’incorporent dans les membranes
20
Q
SDS et LSS
A
- NaSO4(CH2)11CH3
- Détergent ionique fort (dénaturant)
- Utilisé dans les shampoings, dentifrice, savons…
- Fort pouvoir moussant
21
Q
Triton X-100
A
- C8H15C6H4(OC2H4)9OH
- Détergent non-ionique
- Utilisé en cosmétologie car non moussant et moins « irritant » que le SDS
22
Q
agent chaotropique
A
- Déstabilisent les interactions hydrophobes et ponts H, dénaturent les protéines
- Ex: urée 6-8M, guanidine hydrochloride (GuHCl), phénol (corrosif)
- Très pratique pour extraire des protéines insolubles, dénaturation acides nucléiques
23
Q
mélange de phénol-chloroforme
A
- surtout utilisé pour extraire les acides nucléiques
- Le phénol dénature les protéines et le chloroforme dissout les membranes
- Formation de deux phases
- Souvent en combinaison
avec détergents ou agents
chaotropiques pour aider à la lyse
24
Q
tampon de lyse
A
- préserver la conformation/ activité/ structure des - Lyse en milieu physiologique (pH, ions, etc.) avec système tampon
- Lyse douce + précautions à prendre
- Travailler sur glace pour ralentir l’activité des enzymes cellulaires
- Utilisation de réactifs RNase-free/DNase-free (purification acides nucléiques)
- Utilisation d’inhibiteurs de protéases (purification de protéines)
- Ajout d’agents réducteurs (glutathion, DTT, beta-mercaptoéthanol)
25
techniques de purification
- Dialyse
- Filtration
- Centrifugation
- Précipitation
- Chromatographie
- Électrophorèse (surtout analytique)
- Etc.
26
dialyse
- Principe physico-chimique:
- 2 compartiments séparés par une membrane
semi-perméable
- Diffusion de solutés grâce à un gradient de
concentration (atteinte de l’équilibre)
- Plusieurs porosités disponibles
- Méthode simple mais lente (24h...)
27
utilisation de la dialyse
- Dessalage
- Retrait de contaminants
- Concentration de protéines (sln hypertonique)
- Modification de pH
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Exemples de contaminants
fréquemment retirés par dialyse
- Sels et ions
Agents chaotropes
Solvants organiques
Tampons
Sucres, détergents
Inhibiteurs/cofacteurs
Peptides/protéines légères
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filtration
- Utilisation de filtres avec une porosité de grande taille
- Basse pression (seringue ou pompe)
- Principalement utilisée pour retirer débris cellulaires
(clarification), bactéries, résidus solides
- Étape souvent effectuée après extraction et avant
purification via méthodes centrifugation /
chromatographie
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