cours 6 Flashcards
électrophorèse
Séparation de molécules (surtout protéines et acides nucléiques) grâce à une champ électrique
par quoi est influencé la mobilité des molécules
- Taille, charge et forme des molécules
- Puissance du champ
- Force ionique et pH du tampon
- Support ou matrice utilisée pour la séparation
types d’électrophorèse
Sur gel d’agarose
Sur gel d’acrylamide
Immunobuvardage (Western blot)
L’électrofocalisation
électrophorèse sur gel d’agarose
- Principalement utilisée pour la séparation des acides nucléiques, surtout ADN
- Séparation principalement selon la taille des molécules
- Analytique ou pour purification
4 étapes de l’électrophorèse sur gel d’agarose
- Préparation du gel d’agarose
- Dépôt des échantillons
- Migration
- Révélation
préparation du gel d’agarose
- Agarose = forme purifiée de l’agar contenant seulement l’agarobiose
- Agarobiose = polymère linéaire formé d’unités de D-galactose et 3,6-anhydro-L
galactopyranose répétés ~800 fois (hétéropolysaccharide) - Lorsque chauffés et refroids, l’agarose forme naturellement une matrice organisée via la
formation de ponts H entre les chaîne de polymères - On solubilise et chauffe l’agarose dans le tampon utilisée pour la migration
- On coule dans un moule adapté à la cuve d’électrophorèse (plusieurs tailles possibles)
- Peigne avec nombre de puits et volumes variables
bas % de gel d’agarose
séparation de grosses molécules
haut % de gel d’agarose
séparation de petites molécules
% standard de gel d’agarose
1%
dépôt des échantillons
- Mélange des échantillons avec une solution de chargement
(loading dye) de densité élevée (glycérol, sucrose, Ficoll…) - Présence de colorant pour le suivi de migration
- Avec ou sans SDS (dénaturation) et EDTA
migration
- Les tampons les plus utilisés pour la migration d’ADN sont le
TAE (Tris-acétate-EDTA) et le TBE (Tris-borate-EDTA) - le pH est ajusté à 8.0 pour donner une charge négative aux acides nucléiques (groupements phosphates)
- Utilisation de blocs d’alimentation spécialisés
- Voltage généralement entre 80-120V
vrai ou faux
Les petites molécules migrent plus rapidement, les plus
grosses plus lentement
vrai
cause migration rapide
voltage appliqué élevé
cause meilleure séparation
migration longue
révélation
- Utilisation de colorants qui ont une affinité pour les acides nucléiques
- Coloration avant ou après migration
- Classiquement au bromure d’éthidium (agent intercalant, UV)
- Maintenant beaucoup d’alternatives (SYBR-Safe, Safe-T-stain, GelRed…)
- Utilisation de standards de
fragments d’ADN/ARN de
masses moléculaires connues
exemples de migration
- Migration d’amplicons PCR
- Analyse d’extractions d’ADN
génomique - Analyse de l’intégrité d’extractions totales d’ARN
- Confirmation de clonage moléculaire (vecteur + insert)
électrophorèse sur gel d’acrylamide
Principalement utilisée pour la séparation des protéines
* En conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ou non-dénaturantes (natif)
* Surtout analytique (composition, pureté, caractérisation de la masse…)
étapes de l’électrophorèse sur gel d’acrylique
- Préparation du gel de polyacrylamide
- Dépôt des échantillons
- Migration
- Révélation
SDS-PAGE
- Électrophorèse la plus utilisée avec les protéines
- Les protéines varient non seulement en taille, mais aussi beaucoup en charge et forme
- Comment les séparer seulement selon leur taille?- 1% SDS dans le gel et tampon de migration (conditions dénaturantes)- B-mercaptoéthanol + haute température pour réduire les ponts S-S (95oC)
solution de chargement
- 10-20% glycérol
- Colorant pour le suivi de migration (bleu de bromophénol)
- 2-4% SDS
- B-mercaptoéthanol ou DTT
- On chauffe !
révélation
Coloration au bleu de Coomassie
- Simple, rapide et sensible (5-25 ng)
- En conditions acides, interagit préférentiellement avec les acides aminés aromatiques et basiques (biais possibles)
- Surtout pour vérifier présence/absence de protéines
- Compatible avec la spectrométrie de masse
immunobuvardage de type Western
Utilisation d’anticorps spécifiques contre notre protéine à révéler
vérification du transfert
Coloration au Ponceau S (liens faibles facilement réversibles!)
électrofocalisation
Séparation selon le pI des protéines (très sensible)
* Utilisation d’un gel de polyacrylamide avec gradient de pH stable
* Migration jusqu’à l’atteinte du pI
gel 2-dimension (2D)
