cours 9: la thérapie cellulaire Flashcards
1
Q
comment les lymphocytes T cytotoxiques sont capables de détruire les cellules cancéreuses
A
le récepteur TCR des lymphocytes cytotoxiques les reconnait par l’antigène tumoral dans leur récepteur CMH-1, à la surface de la cellule cancéreuse
le TCR le reconnait slmt si le peptide est anormal ou étranger
elles vont induire l’apoptose de ces cellules
2
Q
décrire les étapes de la destruction des cellules cancéreuses par les lymphocytes T cytotoxiques
A
1) Le récepteur TCR du lymphocyte T cytotoxique reconnait l’antigène tumoral sur le récepteur CMH-1 de la cellule cancéreuse; spécificité de la liaison puisque présence d’un peptide anormal étranger ou anormal sur CMH-1
2) Une synapse immunologique se forme entre les 2 cellules, et les granules cytotoxiques du lymphocyte migre vers la cellule cancéreuse
3) La perforine va créer des pores dans la membrane cible, tandis que les granzymes (protéases) vont utiliser ces pores pour pénétrer dans la cellule cancéreuse
4a) Les granzymes vont activer les caspases, ce qui dégrader l’ADN et conduire à l’apoptose de la cellule cancéreuse
4b) La protéine FasL va se lier au récepteur Fas, déclenchant une cascade de signalisation dans la cellule cible; un complexe se forme, se fait endocyter, formant un endosome, qui va recruter des caspases initiatrices— apoptose de la cellule
3
Q
nommer les 3 obstacles empêchant les lymphocytes cytotoxiques de détruire les cellules tumorales
A
1) les cellules tumorales n’expriment pas de protéines spécifiques aux tumeurs;
2) les lymphocytes cytotoxiques expriment des récepteur inhibiteurs;
3) les cellules du microenvironnement expriment aussi des récepteurs inhibiteurs qui réduisent l’action des cellules T
4
Q
décrire comment le fait que les cellules tumorales n’expriment pas de protéines spécifiques aux tumeurs est un problème dans la destruction des cellules tumorales par les lymphocytes T cytotoxiques
A
les lymphocytes ont besoin d’un signal antigénique spécifique (peptide anormal/étranger) pour les reconnaitre et les attaquer;
sans cela, les cellules tumorales passent pour du soi, ne se distinguent pas et donc ne se font pas attaquer; forme d’évasion immunitaire
5
Q
décrire comment le fait que les lymphocytes cytotoxiques expriment des récepteur inhibiteurs est un problème dans la destruction des cellules tumorales par les lymphocytes T cytotoxiques
A
cela inhibe leur prolifération, cytotoxicité, ce qui les empêchent d’attaquer les cellules tumorales
Même si le TCR reconnaît un antigène tumoral, l’activation peut être neutralisée par ces signaux inhibiteurs → le lymphocyte n’attaque pas la cellule tumorale
6
Q
décrire comment le fait que les cellules du microenvironnement expriment aussi des récepteurs inhibiteurs qui réduisent l’action des cellules T est un problème dans la destruction des cellules tumorales par les lymphocytes T cytotoxiques
A
le microenvironnement correspond aux cellules infiltrant la tumeur et aux cellules avoisinantes;
si elles expriment tous des signaux d’inhibition, ceci répresse les lymphocytes T et leur action;
ce qui crée un épuisement fonctionnel des lymphocytes, bloque leur activation et permet aux cellules tumorales de faire leur évasion immunitaire
7
Q
pourquoi les lymphocytes comportent ces récepteurs inhibiteurs
A
ils sont présents afin d’éviter le développement de maladies auto-immunes;
permet de freiner le système immunitaire afin d’éviter l’activation excessive des lymphocytes et les empêcher d’attaquer des cellules normales
8
Q
nommer les 2 solutions établies pour contrer les obstacles concernant l’activité des lymphocytes T sur les cellules tumorales
A
1) isoler les cellules T cytotoxiques fonctionnelles du pt, les faire proliférer et les réinjecter
2) développer, par ingénierie cellulaire, des cellules T cytotoxiques, qui ne sont pas affecter par les obstacles décrits
9
Q
pourquoi isoler les cellules T cytotoxiques fonctionnelles du pt, les faire proliférer et les réinjecter est une solution vouée à l’échec
A
pcq le problème n’est pas dans le nombre des lymphocytes T, mais bien dans leur inhibition par leurs récepteurs;
on en aura plus pour tuer les cellules cancéreuses, mais ils feront face au mm problème (leur désactivation par l’expression de leurs récepteurs inhibiteurs)
de plus, le problème du manque de spécificité persiste, et il n’est pas sûr que ces lymphocytes vont réussir à persister et infiltrer la tumeur au sein du corps
10
Q
dans quelle maladie utilise-t-on le transfert des cellules T cytotoxiques
dans quel but
A
dans la leucémie
prendre les lymphocytes T du pt et les rendre meilleur à attaquer et à détruire les cellules cancéreuses
11
Q
décrire les étapes du transfert des cellules T cytotoxiques
A
1) Exciser la tumeur
2) La couper en morceaux et prélever les lymphocytes T cytotoxiques
3) Les faire proliférer ex-vivo avec ajout d’IL-2 (mitogène stimulant leur prolifération)
4) Effectuer un test de lyse afin de déterminer lesquelles sont capable de tuer des cellules tumorales
5) Les proliférer et les réintroduire chez le patient par transfusion
12
Q
nommer les 2 catégories de transfert de cellules T
A
1) lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL)
2) cellules Car-T (Car-T cells)
13
Q
quel est l’avantage du transfert des cellules T
A
la greffe est autologue; les cellules proviennent du patient lui-mm
14
Q
quels sont les désavatanges du transfert des cellules T
A
-le temps de culture ex-vivo prend plusieurs semaines
-la survie des TIL réintroduits est plutôt faible et de durée limitée
-l’efficacité clinique est moyenne; elles ne fonctionnent pas très bien
15
Q
décrire les étapes de la thérapie des cellules T
A
1) Prélèvement d’un échantillon sanguin, afin d’aller chercher les lymphocytes T
2) Modification du génome des lymphocytes T en insérant le gène pour CAR (récepteur chimérique d’antigène)
3) Prolifération de millions de CAR-T cells
4) Perfusion des cellules CAR-T chez le patient
5) Les cellules CAR-T vont reconnaitre et se lier aux cellules tumorales, sécréter les granzymes + perforines afin de les tuer
16
Q
définir l’anticorps spécifique à la tumeur des CAR-T cells
A
c’est la portion extracellulaire du récepteur chimérique CAR;
composé d’un fragment variable qui détecte l’antigène de tumeur à la surface d’une cellule tumorale
17
Q
de quoi est composée la partie variable du récepteur chimérique des CAR-T cells
A
antigen-binding sites
light chain
partie extracellulaire**
18
Q
de quoi est composée la partie constante du récepteur chimérique des CAR-T cells
A
heavy chains
**partie intracellulaire
19
Q
quel est le rôle de la partie constante/intracellulaire du récepteur chimérique des CAR-T cells
A
l’anticorps va lui envoyer un signal d’activation après sa liaison à l’antigène tumoral;
cela induit la prolifération et la relâche des produits cytotoxiques (granzymes et perforines) afin d’aller cibler la cellule tumorale
responsable de faire la signalisation pour avoir UNE ENTIÉRETÉ de signal du TCR
20
Q
quel est le récepteur principal des CAR-T cells
quel est son rôle
A
récepteur TCR (récepteur chimérique à partie intracellulaire)
21
Q
quels sont les co-récepteurs de TCR sur les CAR-T cells pour induire la signalisation
A
4-1BB
CD28
22
Q
DONC;; comment la cellule CAR-T fonctionne étant composée de récepteur chimérique
A
elle détecte la cellule cible avec son anticorps
+
fait sa signalisation avec 3 queues cytosoliques
23
Q
pk la cellule CAR-T possède-t-elle des co-récepteurs
A
afin de qu’ils miment et renforcent la signalisation naturelle du lymphocyte T
empêche le lymphocyte d’entrer en état inactif; ceci augmente leur efficacité cytotoxique et favorise aussi leur prolifération
24
Q
à quoi sert les queues cytosoliques présentes chez la cellule CAR-T
A
ce sont des domaines intracellulaires qui transmettent des signaux d’activation à la cellule T une fois que l’anticorps a reconnu l’antigène tumoral
activation rapide
meilleure persistance
mémoire et survie à long terme
25
définir le format du lymphocyte T normal (mode TCR seulement)
PORTION EXTRACELLULAIRE: liaison au ligand de la cellule cancéreuse par le récepteur TCR (chaines alpha et bêta)
-reconnait peptide anormal présenté par le CMH de la cellule tumorale
PORTION INTRACELLULAIRE: domaine de signalisation TCR
26
définir le format de la cellule CAR-T de première génération
PORTION EXTRACELLULAIRE: liaison au ligand de la cellule cancéreuse par le portion collante du récepteur chimérique; l'anticorps
-reconnait antigène tumoral spécifique
PORTION INTRACELLULAIRE: domaine de signalisation TCR
27
définir le format de la cellule CAR-T de deuxième génération
PORTION EXTRACELLULAIRE: liaison au ligand de la cellule cancéreuse par le portion collante du récepteur chimérique; l'anticorps
-reconnait antigène tumoral spécifique
PORTION INTRACELLULAIRE: domaine de signalisation TCR + 1 co-récepteur (CD28 ou 4-1BB)
28
définir le format de la cellule CAR-T de troisième génération
PORTION EXTRACELLULAIRE: liaison au ligand de la cellule cancéreuse par le portion collante du récepteur chimérique; l'anticorps
-reconnait antigène tumoral spécifique
PORTION INTRACELLULAIRE: domaine de signalisation TCR + 2 co-récepteurs (CD28 et 4-1BB)
*donc 4 nouvelles molécules sur la cellule*
29
pk la CAR-T cell de 3e génération est capable de faire sa signalisation sans détour
grâce à ses 3 molécules additionnelles intracellulaires; domaine TCR+ 2 co-récepteurs
ainsi, efficacité, durée de vie et fonctionnalité de CAR-T est augmentée
30
qcq VH et VL sur l'anticorps du récepteur des CAR-T cells
VH: région variable de la chaine lourde
VL: région variable de la chaine légère
ils forment la partie du récepteur CAR responsable de la reconnaissance spécifique de l’antigène tumoral.
31
décrire les étapes de signalisation des cellules CAR-T afin de détruire les cellules tumorales
1) La partie extracellulaire du récepteur chimérique des cellules CAR-T, spécifiquement VH et VL, détecte l'antigène tumoral de surface
2) Après liaison de l'antigène, il y a activation de la cellule CAR-T; les 3 domaines transmembranaires (TCR + 2 co-récepteurs) active la cascade signalisation au sein de la cellule CAR-T
3) Il y a activation de la transcription des effecteurs de la cellule CAR-T, comme IL-2 (prolifération) et les produits cytotoxiques (granzymes et perforines)
4) Les granzymes et perforines sont relâchées dans la synapse immunologique entre les 2 cellules; les perforines feront des trous dans la membrane tumorale afin de faire pénétrer les granzymes dans celle-ci
5) La granzyme B va couper Bid, ce qui va la déstabiliser et l'empêcher d'inhiber Bak/Bax, et va couper la procaspase 8, qui va cliver les caspases effectrices afin de les activer
6) Ainsi, il y a induction directe et indirecte de l'apoptose de la cellule tumorale
32
décrire les étapes de comment dans le cas de cancer de types myélome, le stratége des cellules CAR-T est aussi utilisée contre les cellules tumorales
1) Le récepteur chimérique, par sa portion extracellulaire (anticorps), reconnait la protéine BCMA, spécifique aux plasmocytes malades (myélomes)
2) Activation de la cascade de signalisation par TCR et le co-domaine 4-1BB ou CD28
3) Relâche des produits cytotoxiques, afin d'induire l'apoptose chez la cellule tumorale
33
pk les CAR-T cells dans le cas des cancers du myélome ont une grande spécificité à ces cellules tumorales
pcq BCMA, protéine transmembranaire, est peu ou pas exprimée chez les cellules saines, et surtout chez les myélomes
ce qui fait que c'est une cible sûre, et ainsi résulte en une spécificité tumorale élevée pour les CAR-T cells
34
pourquoi le TCR naturel est conservé si on ajoute le récepteur chimérique sur les CAR-T cells, qui s'occupe de la reconnaissance et active les cascades de signalisation
-TCR ne gêne pas et signale indépendament
-le lymphocyte T fonctionnel contient à la base le TCR naturel
-peut aider à maintenir la fonction immunologique naturelle
**le récepteur chimérique est ajouté pour augmenter la spécificité de la reconnaissance; les 2 vont signaler séparément
35
pourquoi les CAR-T cells ciblent les cellules sanguines/immunitaires
puisqu'elles expriment des antigènes uniques, ce qui est plus difficile de trouver chez les tumeurs solides
**cellule est multipliée plusieurs fois; plus facile de cibler une protéine
36
quels sont les effets secondaires de la thérapie CAR-T cells
il y a choc de cytokines qui peut amener la mort;
trop de cellules CAR-T sont activées, détruisant bcp de cellules dans un court intervalle de temps
37
pk les tumeurs solides restent un grand défi dans l'utilisation des cellules CAR-T
puisqu'elles ne sont pas composées de copie de la mm cellule cancéreuse;
il n'y a donc pas de cellule spécifique
à cibler, puisque pas de protéine de surface dans l'ensemble des cellules tumorales
risque aussi de tjrs laisser qq cellules non trouvées
38
nommer les 3 raisons pk les tumeurs solides sont un défi pour les CAR-T cells
1- environnement immunosuppresseur
2- hétérogénéité des cellules tumorales
3- absence d'un antigène unique
39
expliquer l'effet de l'environnement immunosuppresseur des tumeurs solides sur les CAR-T cells
-barrière physique par la forte présence de collagène, fibroblastes, etc
-bcp de cellules inhibant l'activité des lymphocytes T
-conditions métaboliques hostiles (pauvre en O2, riche en lactate, pauvre en glucose), épuisant l'énergie et la survie des lymphocytes T
40
décrire les étapes comment il est possible de faire la regénération de cellules (ex: musculaires) à partir de cellules souches
par thérapie cellulaire dérivée de cellules souches;
1) on prélève les cellules somatiques du malade
2) Reprogrammation génétique en cellules souches pluripotentes induites (iPS), en introduisant un cocktail de facteurs de reprogrammation
3) Les facteurs ramènent la cellule au stade de pluripotence, capable de redonner tous les types cellulaires des 3 feuillets embryonnaires; mésoderme, endoderme, ectoderme
4) Les cellules iPS peuvent ensuite être guidées pour être différenciées en différents types cellulaires spécifiques; pancréatiques, musculaires, érythrocytes (selon le feuillet d'où il provient)
5) Les cellules différenciées sont réintroduites dans le patient et remplacement des cellules perdues ou dysfonctionnelles
41
qcq la dystrophie musculaire des ceintures
mutation dans le gène a-sarcoglycan;
sarcoglycan est une protéine transmembranaire qui fait le lien entre le cytosquelette de la fibre musculaire et la matrice extracellulaire
sans elle; signal défecteux= dégénérescence musculaire
42
cmt les iPSC peuvent être une thérapie pour la DMC
ils vont être transformés en progéniteurs des cellules musculaires;
vont remplacer les cellules musculaires problématiques et regénérer les cellules musculaires striées
43
whats wrong with patients atteints de dystrophie musculaire LGMD2
ils ont une mutation au niveau du gène codant pour l'alpha-sarcoglycan;
ils ont un nombre réduit de cellules progénitrices (mésangioblastes) de cellules musculaires striées
44
décrire les étapes de comment on prouve la régénération des cellules des muscles striées chez les malades de dystrophie musculaire LGMD2 par thérapie cellulaire
1) reprogrammation des myoblastes et fibroblastes humains à partir des cellules du patient en iPSC
2) Ajout du cocktail de facteurs de différenciation Oct4, KLF4 et SOX2; ils activent les gènes de pluripotence
3) Reprogrammation en des iPSC, qui vont se différencier dans la lignée mésodermique (muscle dérive du mésoderme), générant les cellules pré-musculaires HIDEM, similaires aux mésoangioblastes (progéniteur des cellules musculaires)
3) Expansion cellulaire et correction des HIDEMs à l'aide d'expression du gène par transduction avec un lentivirus en présence du gène SGCA et du facteur de transcription MyoD-ER (inductible par tamoxifène afin de stimuler la formation de myotubes)
4) Cocktail génère des LGMD2D HIDEMs; spécifie la différenciation et il y a réintroduction des cellules dans des souris immunodéficientes (KO du gène de sarcoglycan)
5) Analyse de la génération des fibres musculaires; il faut que le mésangioblaste soit capable de migrer et de se localiser dans le muscle, pour finalement générer des fibres musculaires fonctionnelles exprimant sarcoglycan
45
pk la réintroduction des HIDEMs sont faites dans des souris immunodéficientes
empêche le rejet de la transplantation cellulaire par détection de leur système immunitaire, qui les détruira
46
pk utilise-t-on un deuxième cocktail lors de la formation de cellules musculaires corrigées
afin d'assurer que les cellules expriment bien le gène sarcoglycan;
MyoD-ER a un promoteur associé aux populations musculaires; on s'assure que les HIDEMs vont devenir des mésangioblastes-like
47
nommer les ingrédients du cocktail reprogrammant les cellules en pluripotentes
**facteurs de transcription
Oct4
KLF4
SOX2
48
qu'arrive-t-il si après réintroduction des cellules reprogrammées pour le gène du sarcoglycan, les mésangioblastes restent dans la cellule et ne génère rien
il n'y aura aucune fibre musculaire générée
49
quels sont les désavantages du changement des iPSC en HIDEMs
prend bcp de temps
prend bcp de molécules
50
pourquoi lors de la transfo des iPSC en HIDEMs, il y a utilisation d'un inhibiteur de ROCK
il empêche l'activation de la voie ROCK et l'induction de l'apoptose causée par la dissociation cellulaire
51
comment a-t-pu confirmer la différenciation des iPSC lors du processus de formation des HIDEMs l'analyse d'expression de facteurs;
on voit clairement qu'ils perdent l'expression des facteurs liés à la pluripotence des cellules souches;
les facteurs Oct4, SOX2 et KLF4 sont de moins en moins exprimé;
-très haute activité en iPSC;
-juste SOX2 en HIDEM immature;
-aucun facteur en HIDEMs
plus la cellule s'éloigne, plus elle se différencie, plus elle exprime moins de FT liés à la pluripotence
52
comment utilise-t-on la cytométrie en flux pour valider le profil d'expression des HIDEMs matures
la cytométrie permet d'analyser l'expression de certains marqueurs (protéines de surface) de mésangioblastes qui démontrent l'état de différenciation de la cellule
va détecter différents fluorochromes sur la surface de la cellule
on peut voir l'évolution des stades iPSC, HIDEM immature et HIDEM mature
53
nommer les marqueurs de mésangioblastes (progéniteurs de la cellule musculaire) utilisés en cytométrie de flux pour valider le profil d'expression de surface des cellules
CD13
CD44
CD49b
CD146
54
qcqi va reconnaitre les marqueurs sur les cellules
ce sont les anticorps avec fluorochrome (orange) qui vont les reconnaitre, et donc former la courbe sur le profil d'expression
plus la courbe est vers la droite, plus l'expression du marqueur est forte (plus de fluorescence)
55
comment sont les courbes oranges (donc fluorochrome avec anticorps reconnaissant le marqueur des mésangios) lorsque:
stade iPSC
la courbe orange est toute à gauche; faible présence des marqueurs, puisque la cellule possède encore des facteurs de pluripotence
56
comment sont les courbes oranges (donc fluorochrome avec anticorps reconnaissant le marqueur des mésangios) lorsque:
stade des HIDEMs immatures
la courbe se dépalce vers le milieu; de plus en plus d'expression des marqueurs de différenciation
57
comment sont les courbes oranges (donc fluorochrome avec anticorps reconnaissant le marqueur des mésangios) lorsque:
stade des HIDEMs matures
la courbe est à gauche; l'expression du marqueur est plus forte
pusique la cellule est mtn différenciée en mésangioblastes; a perdu ses marqueurs associés à la pluripotence
58
décrire la méthode de cytométrie de flux pour étudier l'expression de la surface des cellules
la technique est utilisée pour analyser et trier individuellement les cellules selon leurs caractéristiques moléculaires (protéines de surface)
-les cellules, marquées par des Ac, sont en suspension dans un liquide
-des marqueurs fluorescents sont utilisés pour cibler les protéines spécifiques de surface
-Elles traversent une à une et passent sous un laser de fluorescence SSC, pour identifier les marqueurs spécifiques
-Un autre laser FSC détecte leur taille
-Les signaux lumineux sont captés par un photodétecteur
-les cellules sont ensuite triées après avoir recu une charge électrique selon ses caractéristiques
59
quel est le rôle de la courbe de contrôle négatif lors de l'analyse de la fluorescence cellulaire après cytométrie de flux
elle représente les cellules sans anticorps de marquage fluorescent
donc pas de protéine ciblée par les fluorochromes; pas de détection
**signal basal de fluorescence; permet de distinguer une cellule vraiment marquée d’une cellule qui émettrait de la fluorescence de façon non spécifique ou naturelle
60
sur quelle échelle est démontrée l'analyse de fluorescence
sur une échlle logarithmique, afin de démontrer l'intensité
plus la courbe est vers la droite, plus l'intensité de la fluorescence fut forte, plus il y avait de marqueur (donc de protéine cible)
61
cmt ecq l'image de microscopie à fluorescence peut démontrer la formation de myotubes in vitro par les cellules HIDEMs
à l'aide de différents colorants, on peut conclure si le mésangioblaste a réussi à fusionner avec la cellule musculaire de la souris;
on peut apercevoir le noyau de la cellule de la souris (bleu) et celle des mésangios humains (blanc) au bon endroit (dans les muscles); donc la formation réussie du syncitium (myoblaste)
62
comment est formée le myotube au sein de la souris
il est formé de la fusion de plusieurs progéniteurs-mésangioblastes
c'est un syncitium
63
quelle culture va-t-on utilisée pour l'image-microscopie à fluorescence pour démontrer la formation de myotube in vitro
cultrue de HIDEMs GFP+ avec des cellules musculaires de souris (myoblastes, C212)
64
pourquoi utilise-t-on MyHC dans la culture de HIDEMs GFP+ avec cellules musculaires de souris
va démontrer la chaine lourde de myosine en rouge, présente dans les myotubes
65
pourquoi utilise-t-on GFP dans la culture de HIDEMs GFP+ avec cellules musculaires de souris
va démontrer, en vert, les HIDEMs issus des patients
66
pourquoi utilise-t-on Lamin A/C dans la culture de HIDEMs GFP+ avec cellules musculaires de souris
va démontrer le noyau des HIDEMs du patient
**puisque l'anticorps est spécifique à la forme humaine de la lamin A/C en blanc
67
pourquoi utilise-t-on Hoescht dans la culture de HIDEMs GFP+ avec cellules musculaires de souris
pour colorer l'ADN en bleu et ainsi voir les noyaux des cellules musculaires des souris
68
cmt ecq on peut imager la correction des iPSC dérivés de patients avec un vecteur codant pour a-sarcoglycan
le vecteur contient MyoD, facteur qui permet la différenciation des HIDEMs en myotubes, et le lentivirus SGCA
sans le vecteur, il y a du MyHC (chaine lourde de la myosine dans les myotubes), mais il n'y a pas d'expression du gène SGCA, et donc des fibres sans a-sarcoglycan
avec le vecteur, il y a du MyHC et présence du gène SGCA, donc des fibres avec a-sarcoglycan; en phase Hoeschst merge, on voit leur présence, ce qui confirme la correction génétique et la différenciation des HIDEMs en myotube
69
HIDEM-LGMD2 corrigé est introduit par IM dans le tibia de la souris;
décrire la coloration Hoechst-Laminine-Lamin A/C du tibia antérieure après une semaine
**donc, on introduit des HIDEMs corrigés par injection IM**
-Hoescht va colorer l'ADN
-Laminine va marquer la matrice extracellulaire
ils sont nécessaires pour démontrer que les HIDEMs sont au bon endroit et ont bien intégré les cellules musculaires
-Lamin A/C marque le noyau des HIDEMs (anticorps spécifique à la forme humaine)
on confirme l'intégration des HIDEMs au sein des cellules musculaires
70
HIDEM-LGMD2-GFP corrigé est introduit par IM dans le tibia de la souris
que voit-on sur le tibia (vue externe) grâce au GFP 1 semaine après l'injection
on peut voir, grâce à la fluorescence émis des HIDEMs par GFP, leur localisation;
ils sont bien au milieu, donc là où le muscle se trouve
71
que remarque-t-on après 1 mois de l'injection IM des cellules HIDEMS-LGMD2 corrigées dans le tibia de la souris
elles sont tjrs présentes et ont proliférées;
elles comportent également moins d'infiltration adipeuse et fibreuse; sécrétion de collagène présente lorsque tissu endommagé-marqueur de dystrophie musculaire (car absence de a-sarcoglycan rend les fibres musculaires fragiles)
**donc, amélioration de la structure musculaire; est plus saine après l'introduction des cellules HIDEMs corrigées
72
que permet l'injection via l'artère principale des HIDEMs corrigées
permet aux cellules de se retrouver au niveau de plusieurs muscles différents (adducteurs, quadriceps), et non juste le tibia antérieur
73
comment peut vérifier la capacité musculaire et moteur des muscles des souris
**mesure de temps de fatigue sur le tapis roulant**
on va vérifier la capacité des souris transplantées et non-transplantées à courir et s'il y a amélioration
**récupération fonctionnelle spontanée au fil du temps que les cellules se différencient
74
que note-t-on comme différence dans la capacité musculaire et moteur des souris transplantées IM et IA lors du test sur tapis roulant
les souris transplantées IM ont une meilleure capacité musculaire que les souris transplantées IA
suggérant que l’injection locale favorise une meilleure intégration et fonction musculaire
75
que note-t-on sur la performance des souris contrôles (sauvages)
il n'y a pas d'amélioration de capacité, puisque elles sont déjà capables et fonctionnelles; elles restent stables
76
que note-t-on sur la performance des souris non transplantées (donc malades)
aucune amélioration, sont malades
77
décrire les vésicule extracellulaires et rôles au sein de la cellule
entourée de membrane cellulaire et contient du matéiel biologique (acides nucléiques, lipides, protéines, organites)
elles n'ont pas la capacité de se multiplier comme une cellule entière; servent notamment pour la communication cellulaire
78
qu'a-t-on réaliser sur les vésicules extracellulaires à des fins de thérapie cellulaire
on a réaliser que puisqu'elles sont utiles pour la communication cellulaire, elles peuvent être utilisées dans la réparation cellulaire
on va les utiliser comme biomarqueurs ou comme véhicule thérapeutique
79
nommer les 3 catégories de vésicules extracellulaires
-exosomes
-microvésicules
-corps apoptotiques
80
définir les exosomes comme catégorie de vésicule extracellulaire
ce sont des vésicuels intracellulaires sécrétées à l'extérieur de la cellule
81
définir les microvésicules comme catégorie de vésicule extracellulaire
vésicule qui bourgeonne à partir de la membrane plasmique
82
définir les corps apoptotiques comme catégorie de vésicule extracellulaire
lorsque la cellule contracte et digère son matériel, va créer des vésicules
83
nommer les catégories des vésicules extracellulaires en ordre de taille
exosomes---petites (30-120 nm)
microvésicules--- moyennes (150-1k nm)
corps apoptotiques--- grandes (1k-5k nm)
84
décrire les étapes du processus de formation des microvésicules (vésicule extracellulaire)
*fragments de la MP qui bourgeonnent directement vers l'extérieur*
1) Recrutement de contenu cytosolique (protéines, lipides)
2) MP se courbe vers l'extérieur; processus de bourgeonnement
3) Protéines, lipides, acides nucléiques (ADN, ARN) et récepteurs (les mm que sur la MP) se retrouvent dans ou sur la microvésicule formée
4) Le col du bourgeon est fermé; vésicule est relâchée dans le milieu extracellulaire
85
décrire les étapes du processus de formation des exosomes (vésicule extracellulaire)
1) La cellule internalise une portion de sa MP avec des protéines de surface (réepteurs à la transferrine) via une vésicule d'endocytose; forme un early endosome contenant du matériel provenant de la membrane et du milieu extracellulaire
2) À l’intérieur du early endosome, des invaginations de la membrane vers l’intérieur forment de petites vésicules internes, appelées ILVs; early endosome va devenir MVB rempli de ces petites vésicules
3) Il y a un tri des protéines, ARN et lipides destinés à être relâchés
4a) Fusion avec lysosome; dégradation du contenu
4b) Fusion avec la MP; libération des ILVs en tant qu'exosomes, contenant protéines, acides nucléiques, lipides, anitgènes, récepteurs, marqueurs d'organites intracellulaires
5) Une fois libérés, les exosomes fusionnent avec d'autres cellules pour leur transférer son contenu; agissent comme des modulateurs de communication cellulaire
86
pk les vésicules extracellulaires sont une bonne facon d'établir une communication avec les autres cellules
pcq si on contrôle ce qu'il y a dans la vésicule, on peut moduler la communication cellulaire en ciblant des processus biologiques
87
comment vont agir les exosomes et microvésicules en tant que communicant cellulaire
ils vont communiquer avec les cellules voisines via des signaux cellulaires
ou
avec un transfert ou relâche du matériel contenu dans leur vésicule
88
donner un exemple de comment relâcher le contenu de la vésicule peut interférer avec la cellule cible
si la vésicule relâche un facteur de transcription ou un microARN,
une nouvelle signalisation cellulaire sera induite au sein de la cellule cible;
VONT INDUIRE UNE EXPRESSION GÉNIQUE
89
nommer des ARN contenus dans les vésicules extracellulaires
microARN
ARNm
ARN long non-codant
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nommer des ADN contenus dans les vésicules extracellulaires
les ssDNA (ADN double brin)
les mtDNA (génome mitochondrial)
les dsDNA (anticorps anti-ADN)
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nommer les 2 facons dont la cellule cible peut capter la vésicule extracellulaire
1) par endocytose après liaison à son récepteur membranaire
2) par fusion directe membranaire
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Expliquer comment le contenu de la vésicule extracellulaire entre dans la cellule cible par fusion membranaire directe
1) La vésicule reconnait la cellule cible par des protéines membranaires spécifiques; déclenche le processus de fusion
2) Les lipides de la MP et ceux de la membrane du vésicule fusionnent, formant une zone de continuité membranaire (trou)
3) La vésicule peut déverser tout son contenu dans la cellule cible directement dans son cytoplasme; interactions fonctionnelles s'ensuivent
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Expliquer comment le contenu de la vésicule extracellulaire entre dans la cellule cible par endocytose après liaison à son récepteur membranaire
1) Il y a liaison entre le ligand contenu dans la vésicule et le récepteur membranaire spécifique de la cellule cible/environnante
2) Ceci déclenche le processus d'endocytose; la MP s'invagine et la vésicule extracellulaire se fait engloutir dans la cellule cible
3) Une fois à l'intérieur, elle est fusionnée avec un endosome pour relâcher son contenu dans le cytosol OU elle est dirigée vers un lysosome et se fait dégradée
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par quelles cellules sont produites les vésicules-corps apoptotiques
par les cellules apoptotiques;
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qu'arrive-t-il aux phosphatidyl-sérines lorsque la cellule se met en voie d'apoptose
normalement, ce sont des lipides à l'intérieur de la MP
lorsqu'en situation d'apoptose, les caspases clivent la flipase; elle va faire fliper les ph-s de l'intérieur à l'extérieur de la cellule
**la reconnaissant comme corps apoptotique
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avant de devenir des corps apoptotiques, comment la cellule se divise
elle se rétrécit en des fragments, qui deviendront après les corps apoptotiques lorsqu'ils auront leur Ph-S flippés à l'extérieur
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décrire les étapes de modification de vésicules extracellulaires lors de thérapie cellulaire avancée contre des plaies chroniques
1) Culture de cellules, souvent souches, qui seront modifiées génétiquement ou chimiquement pour améliorer leur sécrétion en VE
2) Les VE sont isolées et purifiées; elles sont ensuite chargées en agents thérapeutiques, comme des ARNs ou des petites molécules (anti-inflammatoires, antioxydants) pour amplifier leur effet réparateur
3) Les VE sont intégrées dans des matériaux de support, qui ont des propriétés autoréparatrices, antibactériennes, hydratantes, mimiquent la MEC, oxygénantes
4) Le pansement avec VE est appliqué sur la plaie chronique; les VE vont ainsi stimuler la migration cellulaire, l'angiogenèse, et la reconstruction de la matrice cutanée afin de cicatriser la plaie
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cmt peut-on potentialiser l'effet des exosomes sur les plaies/réparations cutanées
on va pouvoir créer une cicatrisation laissant moins de traces sur la peau
**exosomes sécrétées par des
cellules souches mésenchymateuses adipeuses résulterait en une réparation cutanée sans traces par régulation du remodelage de la matrice extracellulaire
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cmt ecq les exosomes, par régulation du remodelage de la matrice extracellulaire, peuvent donner une cicatrisation sans trace
-ils vont réduire la profondeur et la largeur des cicatrices en changeant le ratio des types de collagène
-ils vont changer l'expression de protéine chez les myofibroblastes ainsi que réduire le nombre de ces cellules
-ils vont activer la signalisation ERK régulant la prolifération cellulaire
100
nommer les rôles des collagènes I et III
collagène I: procure une force de résistance à l'étirement et à la pression
collagène III: procure la résilience, plus souple
100
expliquer comment les exosomes vont réduire la profondeur et la largeur des cicatrices en changeant le ratio des types de collagène
ils vont changer le ratio de collagène;
collagène I va diminuer
collagène III va augmenter
101
décrire la différence dans la largeur de la cicatrice entre
-PBS (injection saline) contrôle
-CM-Exo (cells sans exosomes) contrôle
-Exosomes
la cicatrice avec les exosomes sera moins large que celles des contrôles
102
décrire la différence dans la profondeur de la cicatrice entre
-PBS (injection saline) contrôle
-CM-Exo (cells sans exosomes) contrôle
-Exosomes
la cicatrice avec exosomes sera moins profonde que les contrôles
103
décrire la différence dans la densité de collagène de la cicatrice entre
-PBS (injection saline) contrôle
-CM-Exo (cells sans exosomes) contrôle
-Exosomes
les exosomes auront une quantité toale moindre de collagène que dans les 2 contrôles;
**change le ratio de collagène I à III
104
décrire la différence dans la densité d'a-SMA (myofibroblastes) de la cicatrice entre
-PBS (injection saline) contrôle
-CM-Exo (cells sans exosomes) contrôle
-Exosomes
le groupe exosomes aura bcp moins d'a-SMA (myofibroblastes) au niveau de la cicatrice que les 2 groupes contrôle
il y aura une baisse de densité de son marqueur (a-SMA)
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pourquoi est-il préférable pour la cicatrisation qu'il y ait une réduction de myofibroblastes
les myofibroblastes sont des fibroblastes différenciées, à l'origine de tissu granulaire et de la fibrose, axées sur un phénotype pro-fibrotique et contractile
empêcher les fibroblastes de devenir des myofibroblastes, c'est empêcher une accumulation de collagène rigide, de la contraction inutile, et de la fibrose
**on veut regénérer le tissu
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en analysant l'expression de protéine chez des myofibroblastes in vitro;
décrire le changement d'expression de collagène I
au fur et à mesure qu'on ajoute des exosomes
plus on met d'exosomes, moins de collagène I sont exprimés
**puisqu'il est plus fibrotique et n'aide pas à la regénerescence tissulaire voulue
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en analysant l'expression de protéine chez des myofibroblastes in vitro;
décrire le changement d'expression de collagène III
au fur et à mesure qu'on ajoute des exosomes
plus on met d'exosomes, plus de collagène III sont exprimés
**puisqu'il est anti-fibrotique, et aide plus à la regénerescence tissulaire voulue et à une meilleure cicatrisation
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en analysant l'expression de protéine chez des myofibroblastes in vitro;
décrire le changement d'expression de a-SMA
au fur et à mesure qu'on ajoute des exosomes
plus on met d'exosomes, plus le facteur diminue
**marqueur de myofibroblastes; donc moins de myofbroblastes apparaissent, logique avec le changement de ratio vers du collagène III
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en analysant l'expression de protéine chez des myofibroblastes in vitro;
décrire le changement d'expression de TGF-B1
au fur et à mesure qu'on ajoute des exosomes
plus on met d'exosomes, plus TGF-B1 et TGF-B3 augmentent
**TGF-B1 est impliqué dans le recrutement de fibroblastes, la production de collagène; essentiel à la cicatrisation
**TGF-B3 est impliqué dans une cicatrisation plus fine et moins fibreuse; meilleure regénération
les exosomes stimulent aussi les fibroblastes autour, ce qui augmente la sécrétion de ces facteurs
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en analysant l'expression de protéine chez des myofibroblastes in vitro;
décrire le changement d'expression de MMP1 et MMP3
au fur et à mesure qu'on ajoute des exosomes
plus on ajoute d'exosomes, plus il y a de MMP1 et MMP3
**ce sont des protéases qui servent à digérer la MEC et digérer la fibrose présente
donc meilleure cicatrisation
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CD63 est un marqueur d'exosome;
décrire la progression de la présence de ce marqueur sur les cellules des cicatrices traitées entre
-PBS (injection saline) contrôle
-CM-Exo (cells sans exosomes) contrôle
-Exosomes
Il est relativement bas sur les cellules contrôles;
très exprimé chez le groupe exosome; va réduire dans le temps, mais reste plus marqué que dans les groupes contrôles
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pourquoi quantifie-t-on la signalisation de ERK dans ce processus de cicatrisation
ERK est une voie de prolifération, migration et survie cellulaire; des aspects essentiels dans la cicatrisation
les exosomes contiennent plein de protéines, ARN, etc qui vont activer ces voies, puisque ces effets sont bénéfiques à la réparation tissulaire rapide
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pourquoi, dans la quantification de la signalisation ERK, y-a-t-il un groupe ERK et un groupe p-ERK
pcq ERK fait partie d'une voie MAP-kinase; doit être phosphorylé pour être activé;
ERK est présent tt le long de l'expérience, mais doit être activé pour vrm faire effet sur le cicatrisation
which is why we compare ERK group with p-ERK group; *activé (fait effet) après 30 minutes
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décrire la gradation d'expression de p-ERK au fil du temps, avec le mm nombre d'exosomes sur la cicatrice
0min
30min
60min
120min
0: voie inactive; signal basal
30: très exprimée; activation rapide
60: très exprimée
120: très exprimée
**l'activation est maintenue dans le temps et est activée très tôt
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décrire la gradation d'expression d'ERK au fil du temps, avec le mm nombre d'exosomes sur la cicatrice
0min
30min
60min
120min
mm expression intense tout le long;
**quantité totale de la protéine ERK ne change pas ; seule sa forme phosphorylée (activée) augmente
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qcq U0126 et pk l'ajoute-t-on dans l'analyse des exosomes dans les cicatrices exprimant la voie ERK
U0126 est un inhibiteur de la voie de signalisation ERK;
quand on l'ajoute, on perd la signalisation p-ERK
ainsi, lorsqu'il est ajouté aux exosomes, il n'y a plus activation de p-ERK
