cours 10: signalisation 3 Flashcards
1
Q
nommer les rôles du système endocytique/et de sécrétion
3
A
-sécrétion de molécules
-transport de molécules vers divers organites et vers la membrane plasmique
-transport de molécules vers les lysosomes (compartiment acide qui permet la dégradation du matériel biologique)
2
Q
qcq le réseau du trans-golgi
A
c’est un centre de triage qui a plusieurs embranchements;
centre de tri pour le destin des vésicules et de leurs cargos
3
Q
le type COP2 vésiculaire est associé à quel étape du transport médié
A
du RE au cis-golgi
4
Q
quelles sont les protéines du manteau de la vésicule COP2
A
sec23/sec24
sec13/sec31
sec16
5
Q
quelle est la GTPase associée à COP2
A
sar1
6
Q
le type COPI vésiculaire est associé à quel étape du transport médié
A
cis-golgi vers ER
ou
entre les citernes de Golgi
7
Q
quelles sont les protéines du manteau de la vésicule COPI
A
des enduiseurs contenant 7 différents sous-unités COP
8
Q
quelle esr la GTPase associée à COPI
A
ARF
9
Q
quelle est la fonction de la GTPase Sar1
A
elle permet le début du bourgeonnement vésiculaire de la membrane du RE au cis-golgi
son ancrage à la vésicule permet le recrutement de l’ensemble des protéines du manteau
10
Q
le processus de bourgeonnement vésiculaire du réticulum endoplasmique (RE) vers le cis-Golgi implique la formation de quelles vésicules
A
les vésicules COP2
11
Q
décrit les étapes du bourgeonnement vésiculaire de la membrane du RE pour le transport vers cis-golgi
A
1) La GTPase Sar1 se fait activé par la GEF Sec12; elle échange son GDP pour du GTP
2) Sar1-GTP poursuit un changement conformationnel, insérant une queue hydrophobe (N-terminale) dans la membrane, initiant la courbure membranaire
3) Sar-1-GTP recrute les protéines Sec23/Sec24, qui forment la couche interne du manteau de la vésicule COP2; elles vont sélectionner des protéines transmembranaires ou solubles à travers des récepteurs
4) La couche externe est formée par le recrutement de Sec13/Sec31, finissant la distorsion et le bourgeonnement/la formation de la vésicule
5) Une fois la vésicule formée, Sar1-GTP hydrolyse son GTP, ce qui la détache
6) L’hydrolyse du GTP déclenche le désassemblage du manteau COP2; la vésicule nue peut mtn fusionner avec le cis-golgi
7) Les protéines SNARE sont exposées, ce qui est nécessaire à la fusion avec la membrane
12
Q
que se passerait-il lors du bourgeonnement du RE vers cis-golgi si Sar1 pouvait lier le GTP, mais pas l’hydrolyser
A
le manteau ne pourrait pas se désassembler, ce qui ne permettrait pas aux protéines SNARE d’avoir le champ libre pour fusionner avec la membrane
pas de fusion de la vésicule au cis-golgi; la cellule accumulerait des vésicules, mais qui ne peuvent pas fusionner avec les membranes
13
Q
quel est le rôle des protéines SNARE
A
elles permettent la fusion des vésicules avec la membrane cible
14
Q
décrire les étapes du processus de fusion des protéines SNARE avec la membrane cible
A
1) La vésicule approche de la membrane cible; son Rab-GTP va faciliter le recrutement d’un effecteur Rab sur la membrane cible, ce qui positionne la vésicule près de la membrane
2) La V-SNARE (protéine SNARE de la vésicule, nommé VAMP) interagit avec les T-SNARE (protéine SNARE sur la cible, nommé Syntaxine et SNAP-25)
3) Les deux types de SNARE vont former un complexe SNARE en fermeture éclair, qui va tirer les membranes l’une vers l’autre
4) Les complexes SNARE vont tellement approcher les membranes qu’elles vont fusionner; ceci libère le contenu vésiculaire dans le compartiment cible
5) Le complexe SNARE est démantelé par le complexe de protéines NSF et a-SNAP; grâce à l’hydrolyse de l’ATP
15
Q
que permet Rab-GTP sur la V-SNARE
A
va permettre une interaction spécifique, justement par le recrutement d’un effecteur Rab sur la membrane cible
16
Q
après le désassemblage du complexe SNARE par le complexe a-SNAP et NSF, qu’arrive-t-il aux SNARE
A
elles sont remises à la surface pour une nouvelle vésicule
17
Q
définir ce qu’est COP
A
cela forme la couche extérieure de la vésicule;
va déterminer le sens du mvmt (si II ou I) et inclue plusieurs protéines
18
Q
quelle est la direction du transport avec les vésicules COP2
A
transport antérograde; formation de vésicules de cargo du RE et transport vers cis-golgi
19
Q
quelle est la direction du transport avec les vésicules COPI
A
transport rétrograde; formation de vésicules du cargo à partir de cis-golgi et transport vers le RE
20
Q
pour quelles raisons a-t-on besoin du transport rétrograde au sein de la cellule
A
-pour rapporter des enzymes afin de moduler leur activité
-il y a une plateforme de signalisation formée au golgi; lorsqu’elle est terminée, il faut rapporter la protéine pour une nouvelle activation de signalisation (retour des protéines résidantes du RE)
21
Q
cmt ecq le trans-golgi trie les vésicules et leurs cargos
A
il va envoyer la vésicule là où elle doit aller, accompgné du bon manteau
trans-golgi— COP1
lysosome— AP complex
endosome— clathrin
22
Q
nommer les diverses destinations des vésicules quittant le trans-golgi
A
lysosomes
endosomes
membrane plasmique
23
Q
dans quoi est impliqué la voie de cGAS-STING
A
c’est une voie inflammatoire impliquée dans la détection de l’ADN
24
Q
définir ce qu’est cGAS
A
protéine-récepteur qui détecte de l’ADN cytosolique provenant de pathogènes ou microorganismes
25
décrire les étapes de la voie de cGAS-STING lors de détection d'ADN patho
1) Détection d'ADN pathogène cytosolique par la protéine-récepteur cGAS
2) cGAS se dimérise en présence de cet ADN et catalyse la synthèse de cGAMP à partir d'ATP et de GTP
3) cGAMP va agir comme un second messager intracellulaire et va aller lier STING, qui est une protéine transmembranaire du RE
4) STING subit un changement conformationnel et forme des dimères; il se polymérise à la membrane du RE, ce qui induit le signal de bourgeonnement; formation d'une vésicule
5) La vésicule migre du RE vers le Golgi; STING va former une plateforme afin d'activer des facteurs de transcription
5a) STING active NFkb afin d'initier des réponses pro-inflammatoires
5b) STING recrute et active la kinase TBK1, qui va phosphoryler IRF3; IRF3 se dimérise et transloque au noyau, ce qui active un programme de gènes qui va protéger les cellules
6) L'expression des gènes d'interférons-1 déclenchera une réponse antivirale, et ainsi, alertera les cellules voisines
26
définir ce qu'est un interféron
protéines produites par le corps qui stimulent le SI et réduisent la capacité des virus de se reproduire
27
définir le syndrome COPA et par quoi est-elle causée
c'est une maladie auto-immune soulignée par la suractivation de STING;
il y a dérégulation du SI par surproduction de vésicules, sans infection virale, et activation excessive de TBK1/IRF3
**mutation dans le gène COPA (codant pour la sous-unité alpha)
28
quels sont les symptômes présents chez les patients souffrants du syndrome COPA
-des symptômes de grippe ou d'attaque immunitaire continuellement
-inflammation chronique (arthrite, lupus)
-hémorragies alvéolaires
-pneumopathie interstitielle diffuse
-arthrites
29
pour quelle raison les patients COPA ont des hémorragies alévolaires
pcq STING a un impact sur le développement et l'homéostasie pulmonaire;
sa suractivation provoque donc des hémorragies
30
quel est le rôle des vésicules COP2 au sein de la voie cGAS-STING
les COP2 permettent le transport antérograde de STING; de RE au golgi
31
quel est le rôle des vésicules COP1 au sein de la voie cGAS-STING
lorsque la production d'interféron est teminé et qu'on a plus besoin de la plateforme de signalisation au golgi,
on a besoin de ramener STING au niveau du RE pour arrêter la voie
donc, COP1 sont utilisés pour le transport rétrograde vers RE
32
quels sont les protéines rapportées au RE par transport rétrograde sur COP1 lors de la voie cGAS-STING
Surf4; lie STING afin de l'incorporer dans la vésicule COP1 et la rapporter, permet le transport rétrograde
a-COP; se lie aussi à STING pour permettre son retour à RE
protéines de COP1 impliquée dans le recyclage de STING du Golgi vers le RE
33
que va-t-on constater chez l'expression des plasmides codants les mutants a-COP vs celle des mutants de a-COP avec STING
les plasmides codants les mutants, avec STING, vont produire bcp plus d'interférons
vont produire bcp plus de lumière lorsque jumelé à la luciférase**
34
décrire les étapes d'expression de plasmides codants les mutants de a-COP, ligué à une luciférase
1) expression des variants de a-COP ou a-COP et STING
2) activation de STING et production d'interféron
3) Activation du promoteur de l'interféron
4) transcription et traduction de la luciférase
35
lors du plasmide promoteur d'interféron-luciférase
interpréter ce que signifie une grande quantité de lumière
plus de lumière, veut dire qu'on a plus d'activité de l'interféron, et donc plus d'activité de STING
36
avec quoi réagit la luciférase lorsqu'elle est exprimée pour produire de la lumière,
réagit au substrat présent dans le milieu
37
à quoi est proportionnelle la quantité de lumière du plasmide
à l'activité du promoreur et de l'expression du gène
donc, à l'activation de la voie STING et l'activité de l'interféron
38
qcqi active la voie de signalisation de STING avec les mutants de a-COP, qui ne devrait pas le faire
elle s'active mm en l'absence d'ADN stimulant (ADN pathogène ou de micro-organismes)
39
quelle marque d'activation de STING peut-on cibler lors de l'analyse des mutants de a-COP
celle de la phosphorylation de TBK1; elle marque la présence de phosphorylation d'IRF3, qui va être transloquée au noyau et activer l'expression des gènes pour exprimer les interférons
si pas de STING, pas de p-TBK1
40
s'il n'y a pas de présence de STING dans le mutant de a-COP, comment varie la présence de p-TBK1
sans STING, il n'y a pas de p-TBK1, car elle est nécessaire à son activation
41
s'il y a présence de STING, comment varie la présence de TBK1 chez les mutants de a-COP
elle reste la mm; TBK1 est tjrs présente dans la cellule
42
s'il y a absence de STING, comment varie la présence de TBK1 chez les mutants de a-COP
elle reste la mm; la kinase TBK1 est tjrs présente dans la cellule
43
s'il y a présence de STING, comment varie la présence de p-TBK1 chez les mutants de a-COP
elle est exprimée, puisque la voie STING l'active
44
l'expression de quels gènes est induit par l'expression des mutants de a-COP
-gènes de l'interféron (antiviraux)
-gènes inflammatoires (comme NFkb)
**résultats montrent que les mutants a-COP !surexpriment! ces gènes**
45
que suggère la surexpression des gènes d'inflammation et des interférons par les mutants de a-COP
suggèrent que ces mutations empêchent a-COP de fonctionner correctectement, ce qui perturbe le recyclage et transport rétrograde de STING, le maintenant activé au Golgi
activation chronique de STING**
46
où se trouve a-COP (sous-unité alpha de COP1)
elle est dans les protéines du manteau de la vésicule
donc impliqué dans le transport rétrograde
47
nommer les étapes de quantification par RT-qPCR des gènes d'inflammation
1) Modulation de l'expression des gènes
2) Augmentation ou diminution de l'ARNm
3) cDNA (rétro-transcription de l'ARNm)
4) qPCR avec des amorces spécifiques pour chaque gène
48
où se localisent STING et p-TBK1 lorsque les mutants de a-COP sont exprimés
ils se trouvent au Golgi, alors qu'ils devraient se trouver au RE
49
qcq TGN38
c'est une protéine du trans-golgi; marqueur de cette position dans la cellule
50
donner les localisations de STING et TGN38 dans:
cellule contrôle négatif, pas de surexpression de COP
STING est diffus et ne se trouve pas au mm endroit que TGN38; se trouve au RE comme attendu
TGN38 se trouve au golgi
pas de colocalisation
51
donner les localisations de STING et TGN38 dans:
cellule WT, expression COP
STING est faiblement au Golgi par petite colocalisation avec TGN38, mais peu ou pas d'accumulation
STING éparpillé via RE
52
donner les localisations de STING et TGN38 dans:
cellule mutante de a-COP
on perd la localisation attendu de STING; s'accumule fortement au Golgi, colocalisation claire avec TGN38
défaillance du recyclage rétrograde vers le RE et activation continue de STING (puisque actif lorsqu'au golgi)
53
donner l'expression de STING et p-TBK1 dans:
cellule contrôle négatif, pas de surexpression de COP
pas d'activation de la voie, donc pas de p-TBK1 et STING reste au RE
54
donner l'expression de STING et p-TBK1 dans:
cellule WT, expression COP
pas activation de p-TBK1, puisque pas d'activation de STING
55
donner l'expression de STING et p-TBK1 dans:
cellule mutante de a-COP
forte présence de p-TBK1 et accumulation au mm site que STING;
donc activation persistante de STING au Golgi, pas de transport rétrograde
56
la perte de quelle protéine de la voie STING a un effet similaire à l'expression des mutants de a-COP
la perte d'expression de Surf4, qui permet le transport rétrograde de STING au sein de COP1 avec a-COP
57
qu'arrive-t-il à la localisation de STING lorsqu'on perd l'expression de SURF4
on la retrouve au golgi
58
quels marqueurs permettent de démontrer la localisation de STING au golgi lors de la perte d'expression de SURF4
on a utilisé des marqueurs de Golgi, comme TGN38 et GM130
s'ils se retrouvent au mm endroit, c'est que STING est suractivé et le transport rétrograde est perturbé
59
lorsqu'on enlève SURF4, en plus de la localisation de STING au golgi, que peut-on voir apparaitre dans les niveaux d'expression de la cellule
p-TBK1 va apparaitre lorsque SURF4 esr retiré;
puisque STING reste activé au golgi, il continuera de phospo TBK1 et d'activer les voies d'inflammation et d'interférons
60
comment peut-on régler le problème de transport rétrograde de COPA
en développant des inhibiteurs de STING, ce qui inhibirait tt les voies suivantes (inflammation et interférons)
61
définir ce qu'est l'anémie de fanconi
maladie génétique qui affecte la moelle osseuse, l'empêchant de faire des plaquettes, des globules rouges et des globules blancs
62
à quelles autres maladies mène l'anémie de fanconi
insuffisance médullaire
leucémie
des tumeurs
63
nommer les symptômes des patients atteints d'anémie de Fanconi
-numération globulaire anormale
-problèmes dermatos
-déficience hormonale
64
par quoi est causé le syndrome d'anémie de fanconi
elle est causée par une dysfonction des protéines du complexe FANC
65
définir ce qu'est la voie de Fanconi et quel est son rôle dans notre corps
elle est impliquée dans la réparation des dommages à l'ADN, spécifiquement des pontages inter-brins
elle dirige la réparation des dommages vers la voie de recombinaison homologue
66
cmb de protéines comporte la voie de fanconi, et que font-elles
il y a 23 protéines dans la voie de Fanconi, qui ont des rôles différents durant la réparation des dommages à l'ADN
**aussi d'autres fonctions cellulaires, comme dans la cytocinèse (cellule mère se divise en cellule filles), autophagie et réplication de l'ADN
67
pour quelle raison la voie de fanconi dirige la réparation des dommages vers la voie de recombinaison homologue, plutôt que non-homologue
pcq elle permet de garder l'intégrité du matériel génétique
68
qu'arrive-t-il lorsqu'il y a défaut de la voie de fanconi
les réparations des dommages à l'ADN sont dirigés vers la voie de recombinaison non-homologue NHEJ;
plus mutagénique
69
définir pk la NHEJ (recombinaison non-homologue) est plus mutagénique
les molécules jointes peuvent avoir peu ou pas d'homologie,
pas de brin matrice guidant,
les extrémités cassées sont souvent clivées ou remplies au hasard, ce qui provoque des délétions, des insertions, mutations ponctuelles
70
décrire cmt la voie de fanconi est activée brièvement
-dommages à l'ADN se produisent
-complexe se forme et recrute les autres protéines de la voie
-vont ultimement activer les protéines effectrices de réparation d'ADN
réparation par recombinaison homologue (PRÉFÉRABLE) ou par NHEJ
71
décrire les étapes de la recombinaison homologue
1) Utilisation d'un brin homologue au brin comportant un bris d'ADN sur une chromatide soeur (cassure double brin)
2) La cassure est reconnue par le complexe MRN, qui va traité les extrémités de l'ADN afin de créer des protubérances simple brin;
3) Rad51, Rad52 et RPA s'associent aux protubérances, suivis par la formation d'une molécule commune par les brins endommagés et non endommagés.
4) Synthèse d'ADN guidée par modèle; polymérisation de facon à copier la séquence homologue intacte
5) Résolution des deux brins; réparation complète du bris d'ADN, tout en gardant l’entièreté du génome
72
décrire les étapes de la recombinaison non-homologue (NHEJ)
1) Rassemblement des extrémités de la molécule d'ADN brisées par la formation d'un complexe synaptique; composé de 2 extrémités d'ADN, 2 molécules Ku70/80 et 2 molécules de DNA-PK
2) Les extrémités d'ADN non-compatibles sont rapprochées et traitées pour former des terminaisons qui se lient; elles sont clivées, remplies
3) Une fois les bouts rendus compatibles, réparation de la cassure et liaison des bouts par le complexe ligase IV/XRCC4
73
que vont activer plus fortement les cellules avec un défaut de la voie de Fanconi en réponse à un agent de pontage de l'ADN
elles vont activer plus fortement la protéine p53
74
on étudie l'expression de p53 dans les lymphocytes T avec un inducteur de pontages inter-brins d'ADN
quelle est la différence dans leur expression de p53 chez les non-FA et les FA
les cellules non-FA, mm après 75ng ajouté d'agent inducteur, n'auront qu'une faible expression de p53
alors que les cellules FA, mm à 0ng d'agent inducteur, auront déjà une faible activation de la voie p53; vont augmenter son expression rapidement, de plus en plus que MMC est ajouté; elles sont extrêmement sensibles au dommage de l'ADN
75
on étudie l'expression de p53 dans les fibros avec un inducteur de pontages inter-brins d'ADN
quelle est la différence dans leur expression de p53 chez les FANCA mutées et les non-FANCA
FANCA; un des gènes majeurs du système de réparation de l’ADN par la voie de Fanconi
chez les cellules FANCA mutées, p53 est activé mm à 0ng d'agent inducteur; son expression augmente progressivement
chez les cellules FANCA corrigées, p53 n'est pas vrm exprimé; reste à un niveau basal d'expression, et est bcp moins induit par l'agent de pontages d'ADN; retourne à des niveaux comme un pt sain
76
on étudie l'expression de p53 dans la moelle osseuse de souris sauvages et mutées Fancg avec un inducteur de pontages inter-brins d'ADN
quelle est la différence dans leur expression de p53 chez les WT et les Fancg
FANCG est une protéine essentielle du complexe, qui participe aux réparations de l'ADN; sa perte rend les cellules hypersensibles
les souris sauvages limitent l'activation de p53 grâce à leur réparation efficace des dommages par la voie Fanconi
les cellules mutées (Fancg KO) démontrent une activation exagérée de p53; cela démontre une accumulation non-réparée de dommages à l'ADN
77
si on fait une coupe osseuse chez les patiens d'anémie de Fanconi, que remarque-t-on
une aplasie médullaire; il n'y a presque plus de cellules;
manque important en globules rouges et blancs par le manque de cellules souches hématos; la moelle osseuse est incapable de produire le niveau de cellules sanguines normal
ceci fait tomber le pt en anémie
78
à quelle autre maladie sont prédisposés les patients de FA
ils ont une prédisposition au cancer
**et ils ont une aplasie médullaire, touchant particulièrement les cellules souches hématos
79
si on mesure l'activation de p53 dans les noyaux de patients sains VS dans les noyaux des patients atteints de FA
comment les niveaux différent-t-il
p53 est bcp plus activée chez les patients FA, sans mm ajouter d'agents causant des dommages à l'ADN
80
par quelle méthode mesure-t-on les niveaux de p53 au noyau
par marquage à la fluorescence
81
comment utilise-t-on les shRNA dans l'étude de signalisation cellulaire
ce sont des petits ARN en épingle pouvant être utilisés pour réduire l'expression d'un gène cible
82
définir ce qu'est FANCD2
c'est une des protéines de la voie de Fanconi
83
en utilisant shRNA pour réduire l'expression de FANCD2,
décrire la différence d'expression de p53 et p21 chez des patients contrôles VS chez des patients shFANCD2
les patients sains présentent la protéine FAND2, un niveau basal de p53 et pas de présence de p21
les patients shFANCD2, puisque ne présentant pas la protéine FANCD2, ont un niveau exagéré de p53 présent, sans agents de dommages à l'ADN, et une expression de p21 (CDKi)
84
décrire l'expression de p53 et de p21 chez des souris:
cellules BM sauvages avec FANCD2, sans radiation
il y a des niveaux normaux de p53 et p21; très faibles, ce qui est normal puisque pas de dommages à l'ADN
FANCD2 est présente
85
décrire l'expression de p53 et de p21 chez des souris:
cellules BM sauvages, avec FANCD2, avec radiation
il y a des niveaux normaux plus forts de p53 et p21; ils sont activés, ce qui est normal puisque dommages à l'ADN présents par la radiation
FANCD2 est présente
86
décrire l'expression de p53 et de p21 chez des souris:
cellules BM mutées sans FANCD2, sans radiation
il y a présence d'expression p53 et p21, mm sans dommages à l'ADN
FANCD2 n'est pas présente
87
décrire l'expression de p53 et de p21 chez des souris:
cellules BM mutées sans FANCD2, avec radiation
la radiation ne fait qu'augmenter les niveaux déjà présents de p53 et p21 dans la cellule, puisque mtn il y a en plus des dommages à l'ADN (la cellule est mutée, donc hypersensible)
pas de FANCD2
88
pk va-t-on utiliser l'analyse par cytométrie en flux des cellules de la moelle osseuse
**contexte de FA
on va quantifier le nombre de cellules souches hématos par la fluorescence;
critères comme taille ou intensité sont associés à des couleurs de fluorescence
89
que permet la perte de p53 chez les patients FA
son KO permet de retrouver un nombre presque normal de cellules souches de la moelle osseuse
90
décrire ce qu'est le marqueur Lin, utilisé lors de l'analyse de cytométrie chez les cellules souches des patients FA
c'est un ensemble de marqueurs de différenciation des cellules sanguines
91
les cellules souches sont-elles positives ou négatives pour les marqueurs Lin
elles sont négatives;
cellules souches; Lin-
92
décrire ce que sont les marqueurs Sca-1 et c-kit, utilisé lors de l'analyse de cytométrie chez les cellules souches des patients FA
ce sont des marqueurs de cellules souches
93
les cellules souches sont nommées LSK pour englober tous leurs marqueurs
nommer-les
LSK: Lin-, c-kit+, Sca-1+
94
on analyse par cytométrie de flux la présence de cellules Lin-, donc qui n'expriment pas de marqueurs de différenciation
quelle sera l'expression de la moelle osseuse des souris sauvages VS des souris KO fancd2 VS des souris KO fancd2-p53
si on gate pour Lin-;
SOURIS SAUVAGE: on a un % d'expression normal de cellules souches (3.69)
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi abaisse le niveau de cellules Lin-, donc perte de cellules souches à la BM (2.85)
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait remonter le niveau de cellules Lin-, donc de cellules souches (3.6)
95
on analyse par cytométrie de flux la présence de cellules LSK, donc des cellules souches Lin-, c-kit+ et sca-1+
quelle sera l'expression de la moelle osseuse des souris sauvages VS des souris KO fancd2 VS des souris KO fancd2-p53
si on gate pour LSK;
SOURIS SAUVAGE: on a un % d'expression normal de cellules souches (5.36)
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi abaisse le niveau de cellules LSK, donc perte de cellules souches à la BM (3.21)
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait remonter le niveau de cellules LSK, donc de cellules souches (7.33)
96
quand on gate pour Lin-, sur le graphique, alors que lineage fait l'axe des x
où veut-on retrouver nos cellules souches sur le quadrant
on veut les retrouver à gauche, puisqu'elles sont Lin-
97
quand on gate pour LSK, sur le graphique, alors que sca-1 fait l'axe des x et c-kit fait l'axe des y
où veut-on retrouver nos cellules souches sur le quadrant
on veut les retrouver en haut et à droite; elles doivent exprimer le plus possible ces marqueurs de cellules souches (elles sont c-kit+ et sca-1+)
98
on mesure le % de la fréquence des LSK
décrire la différence entre les souris sauvages VS les souris KO fancd2 VS les souris KO fancd2-p53
SOURIS SAUVAGE: on a un % d'expression normal de LSK- cellules souches
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi fait perdre le nb de cellules souches
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait remonter le % de cellules LSK, donc de cellules souches
99
pk mesure-t-on aussi, dans cette analyse des LSK chez FA, la capacité de former des colonies sur un tissu de cellules
pcq parfois, la cellule est vivante, mais ne prolifère pas
alors qu'on veut que les cellules souches proliférent afin de régler l'aplasie médullaire et ainsi la FA
**c'est un indicateur de cellules souches hématopoïétiques à long terme
100
on mesure le nb de LSK vivantes;
décrire la différence entre les souris sauvages VS les souris KO fancd2 VS les souris KO fancd2-p53
SOURIS SAUVAGE: on a un nb de LSK vivantes normal
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi fait chuter presque à 0 le nb de LSK vivantes
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait remonter le nb de cellules LSK; presque au mm niveau que WT
101
on mesure la capacité des cellules de la moelle osseuse à former des zones de prolifération après 28 jours (voir l'effet long terme);
décrire la différence entre les souris sauvages VS les souris KO fancd2 VS les souris KO fancd2-p53
SOURIS SAUVAGE: on a un nb de prolifération normale, ce qui indique une forte capacité de maintien des cellules souches
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi fait chuter la fonction des cellules souches, par accumulation des dommages non-réparés et activation de p53; réduit leur survie
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 restaure partiellement la fonction de prolifération des cellules souches; elle retrouve leur capacité de former des colonies sur le tissu de cellules
102
définir ce qu'est le marqueur 7AAD
marqueur d'apoptose; il entre slmt dans les cellules mortes (puisque leur membrane plasmique perd son intégrité) et se lie à leur ADN
103
définir ce qu'est le marqueur Annexin V
on l'utilise également pour marquer les cellules apoptotiques, car il se lie à la phosphatidylsérine
la phosphatidylsérine est un lipide flippé sur la membrane après clivage de la caspase; en cas de voie d'apoptose activée chez cette cellule
104
si on marque un quadrant, avec les axes 7AAD et Annexin V;
où vont se trouver les cellules d'un pt atteint de FA
elles vont être fluorescentes en haut et vers la droite;
caractérisée par le défaut de leur voie de Fanconi, donc défaut de réparation de dommages à l'ADN, accumulation des cassures et activation de p53 (apoptose)
105
si on marque un quadrant, avec les axes 7AAD et Annexin V;
où vont se trouver les cellules d'un pt sain
ses cellules seront plutôt dans le quadrant en bas à gauche;
les cellules savent réparer leurs dommages, sans activation nécessaire de p53, puisque leur voie de fanconi effectue des réparations efficaces
106
avec quels aspects de la FA corrèle un défaut de cytocinèse
cela corrèle avec l'augmentation de cellules apoptotiques chez les cellules FANCD2-;
-il y a augmentation de cellules binuclées, qui ne devraient pas arriver chez une cellule proliférante (problème au niveau de la mitose)
il y aura donc des niveaux plus élevés d'apoptose également
107
on mesure le % de cellules LSK binuclées;
décrire la différence entre les souris sauvages VS les souris KO fancd2 VS les souris KO fancd2-p53
SOURIS SAUVAGE: on a un nb assez bas de LSK binuclées, processus de mitose normal
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi fait drastiquement augmenter le % de LSK binuclées, par défaut de réparation de l'ADN, qui mène à l'échec de la cytocinèse
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait redescendre le niveau de % de LSK binuclées
108
on mesure le % de cellules LSK positive à l'annexine V;
décrire la différence entre les souris sauvages VS les souris KO fancd2 VS les souris KO fancd2-p53
SOURIS SAUVAGE: on a un nb normal de LSK annexineV+
SOURIS KO FANCD2: la perte de cette protéine de la voie de Fanconi fait drastiquement augmenter le % de LSK annexineV+, par défaut de réparation de l'ADN, qui suractive p53, et donc l'apoptose
SOURIS KO FANCD2 P53: la perte de p53 fait redescendre le niveau de % de LSK annexineV+, par reprise du contrôle de la réparation de l'ADN, et donc moins d'apoptose déclenchée
109
on a pris des cellules souches hématos (CD34+cells);
décrire leur différence d'expression de p53 si shFANCD2 et shFANCD2-P53
shFANCD2 va bcp plus exprimer p53 que les cellules contrôles, encore une fois par accumulaton des dommages d'ADN
shFANCD2-P53 va faire chuter le niveau de p53, par son KO
110
on injecte les cellules souches hématos shFANCD2 et shFANCD2-P53, ajoutés à des gènes de GFP, dans une souris
comment la souris doit être préparée pour qu'elle ne rejette pas ces cellules humaines
il faut qu'elle soit immunodéficiente
111
pour le reste de l'expérience des cellules souches hématos dans la souris, quel marqueur va-t-on utiliser et pk
on va utiliser CD45; marqueur de globules blancs/leucocytes
va permettre de savoir si les cellules souches hématos injectées ont réussi à se différencier correctement au sein de la souris
112
décrire la présence des cellules souches hématos shFANCD2 au sein de la souris
si le quadrant est de GFP-shFANCD2 pour l'axe des x et CD45 pour l'axe des y
la fluorescence des cellules va se trouver en bas à gauche; très peu ont émergé du modéle
ce qui est normal, puisqu'elles n'ont pas de protéine FANCD2, donc pas de prolifération des cellules souches
**4.9% de cellules différenciées
113
décrire la présence des cellules souches hématos shFANCD2-p53 au sein de la souris
si le quadrant est de GFP-shFANCD2-p53 pour l'axe des x et CD45 pour l'axe des y
la fluorescence des cellules va se trouver plus au milieu, vers la droite;
grande différence avec le groupe shFANCD2, puisque le KO de p53 des cellules souches hématos de ce modèle leur a permis de se multiplier et se différencier en cellules sanguines (ce que CD45 confirme)
**34% de cellules différenciées!!
114
DONC;
que démontrent les cellules issues de patients FA (comparé à la normale)
-accumulation de dommages à l'ADN
-plus grande proportion de cellules apoptotiques
115
DONC;
quand ecq p53 est activé
lorsqu'il y a des dommages à l'ADN et peut induire l'apoptose en cas d'incapacité de réparer les bris
116
DONC;
en quoi résulte la perte de p53
cela réduit significativement la perte de cellules souches hématos chez les souris FANCD2-
117
mm si p53 permet de restaurer partiellement les fonctions des cellules FANCD2-, quelle est la contrepartie
il y aura accélération du développement de la tumeur chez ces mm souris;
administrer un inhibiteur de p53 ne serait pas une solution pour les patients FA, qui sont déjà très susceptibles de développer le cancer, puisque la perte d'apoptose dans tt les cellules permettraient aux cellules tumorales de proliférer et se propager sans danger
118
chez les pt de FA, la balance de recombinaison des bris d'ADN est axée sur quelle méthode? comment?
il y a augmentation de la signalisation TGF-B et axe sur la recombinaison non-homologue (NHEJ);
119
quelles sont les conséquences de cellules FA axées sur la recombinaison non-homologue
-perte de cellules souches hématos
-insufffisance médullaire
120
quelle serait une bonne alternative au sein des pts FA pour augmenter la survie des cellules souches hématos
inhiber la signalisation TGF-b, ce qui changerait la balance de réparation d'ADN vers de la recombinaison homologue, qui est moins mutagénique
121
quels sont les principaux gènes induits par un stress génotoxique (mytoycine C-MMC) de la voie TGF-b
BMP2
SMAD3
PDCD4
122
quels sont les principaux gènes induits par un stress génotoxique (mytoycine C-MMC) du métabolisme de MMC
NQO1
NFE2L2
123
quel gène de la voie TGF-b peut-on retirer pour que les cellules des pts FA survivent mieux aux dommages
on inactive SMAD3, médié par shRNA
on empêche donc la signalisation TGF-b
124
qu'arrive-t-il au taux de survie des cellules shSMAD3, si en plus, on réexprime la forme sauvage de Fanca
la survie est encore plus grande des cellules après les dommages cellulaires
125
en quoi la signalisation TGF-b est négative pour les cellules souches hématos des souris KO fancd2
la signalisation TFG-b nuit à leur prolifération et leur maintien
**par le fait qu'elle penche sur NHEJ
il y a près de la moitié des cellules qui survivent, comparé au modèle sauvage
126
si on enlève SMAD3 en plus de KO fancd2 chez les cellules souches, cmt est la survie
on retrouve la survie des cellules au mm niveau que le modèle sauvage, grâce à la perte de signalisation TGF-b
127
que va favoriser la déplétion de smad3 chez les souris aux cellules souches transplantées (modèle gfp)
cela va favoriser la capacité de prise de greffe de ces cellules de la moelle osseuse fancd2-
128
on teste la formation de colonies montrant la résistance à l'acétaldéhyde
*cellules CSH fancd2-
*cellules CSH fancd2- 1D11 (anticorps bloquant TGFB)
comment vont différer leurs résultats et que peut-on conclure
on détermine la survie des progéniteurs hématopoietéiques par la quantification de colonies;
comme attendu, le modèle fancd2- va produire bcp moins de colonies que celle de fancd2-/1D11
DONC, bloquer la signalisation de TGFB au sein des cellules FA améliore la prolifération cellulaire
129
on teste l'efficacité de réparation des bris d'ADN de colonies après exposition à l'acétaldéhyde en mesurant yH2AX dans:
*cellules CSH WT
*cellules CSH fancd2-
VS
*cellules CSH WT traité au 1D11
*cellules CSH fancd2 traité au 1D11
comment vont différer leurs résultats et que peut-on conclure
DANS LE PREMIER GROUPE:
WT: après acétylaldéhyde, il y aura formation des foyers yH2AX, illustrant les cassures; après temps de récupération de 20h, comme attendu, il n'y a plus aucune brisure
fancd2-: après acétylaldéhyde, il y aura formation des foyers yH2AX, illustrant les cassures; mais après temps de récupération de 20h, les bris seront toujours apercevables sur la cellule
alors qu'avec traitement 1D11 (donc utilisation de l'anticorps pour bloquer la signalisation TGFB), les cellules fancd2- auront la mm capacité de réparer leurs bris que les cellules WT
DONC; bloquer TGFB permet d'améliorer la réparation des bris d'ADN des cellules FA
130
il est vrai qu'il est nécessaire que les cellules FA puissent réparer les bris d'ADN, mais quel est le but ultime du blocage de TGFB
réparation de bris par activité HR dans les cellules FA
131
qcq RAD51
c'est un marqueur de la réparation par recombinaison homologue
132
décrire RAD51 sur les cellules GM6914 (FA) contrôle après exposition à MMC, puis récupération pdnt 24-48h
très peu de foyers RAD51 sont visibles, à tous les temps;
on le sait, puisque les cellules FA n'utilisent pas efficacement la recombinaison homologue,
133
décrire RAD51 sur les cellules GM6914 (FA) shSMAD3 après exposition à MMC, puis récupération pdnt 24-48h
il y a apparition de foyers dès 6h, ce qui affirme la présence de recombinaison homologue, et donc d'inhibition de TGFb
les foyers disparaissent avec le temps, ce qui signifie que les cassures se sont fait réparer
134
décrire RAD51 sur les cellules GM6914+ FANCA contrôle, après exposition à MMC, puis récupération pdnt 24-48h
les foyers apparaissent, puis disparaissent normalement; la voie de Fanconi a été réparé
réparation HR fonctionnelle; contrôle positif
135
décrire RAD51 sur les cellules GM6914+ FANCA shSMAD3, après exposition à MMC, puis récupération pdnt 24-48h
mm résultats que le contrôle positif; inhibition de SMAD3 n'est mm pas nécessaire puisque la cellule fut réparée
utilisation efficace de recombinaison homologue
136
que suggère une présence prolongée de RAD51 au sein de la cellule
le recrutement de RAD51 est supposé être temporaire pour la recombinaison homologue;
si mm après récupération, les foyers sont tjrs présents, cela indique que les bris persistent (réparation incomplète), ou que la résolution est défectueuse
137
on traite les cellules GM6914 (FA) avec du MMC;
on évalue le % de cellules avec des foyers RAD51 après 0-6-24-48
décrire la progression de ce groupe de cellules
il y a accumulation des foyers, et leur persistance mm après 48h;
cela suggère que les bris persistent et qu'on a une recombinaison défectueuse
*contrôle négatif
138
on traite les cellules GM6914-shSMAD3 avec du MMC;
on évalue le % de cellules avec des foyers RAD51 après 0-6-24-48
décrire la progression de ce groupe de cellules
les foyers RAD51 vont s'accumuler slmt jusqu'à 6h, puis disparaitre drastiquement dans les 24-48h
recombinaison homologue réparée par l'inhibition deTGFB; les bris ont donc été reconnus et réparés
139
on traite les cellules GM6914+FANCA avec du MMC;
on évalue le % de cellules avec des foyers RAD51 après 0-6-24-48
décrire la progression de ce groupe de cellules
contrôle positif; les cellules sont réparées;
il y a donc accumulation des foyers, ouis leur disparition progressive après réparation des bris
140
on traite les cellules GM6914+FANCA-shSMAD3 avec du MMC;
on évalue le % de cellules avec des foyers RAD51 après 0-6-24-48
décrire la progression de ce groupe de cellules
mm résultats que le controle positif, les cellules sont déjà réparées
vont accumuler les foyers -6h- puis les faire disparaitre avec réparation correcte par recombinaison homologue des dégâts
141
DONC,
on inhibant la voie TGFB..
on favorise la correction via RAD51, donc via recombinaison homologue
