Cours 8 - Culture de Gène Flashcards
Nommez 3 utilités à introduire un gène dans une cellule
1) Souris transgénique pour étudier la FONCTION d’un gène
2) Étudier les CONSÉQUENCES d’une mutation d’un gène sur le fonctionnement d’une cellule
3) Examiner COMMENT un gène contrôle l’expression d’autres gènes
Nommez 3 catégories de stratégies pour introduire l’ADN
1) Force physique (Billes d’or)
2) Produits chimiques (Liposomes)
3) Vecteurs viraux
Qu’est-ce que la transfection
Fait référence à une méthode non-virale pour introduire de l’ADN dans une cellule
Qu’est-ce que la transduction
Implique que l’ADN est introduit par un vecteur viral (Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN)
Nommez les 3 facteurs qui déterminent la selection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule
1) L’environnement cellulaire (in vivo vs vitro)
2) Type cellulaire
3) Le but de l’expérience
Vrai ou Faux
La force physique est une bonne stratégie pour introduire l’ADN dans un neurone
Faux
Les neurones sont trop fragiles
Nommez les 3 caractéristiques importantes pour les stratégies pour introduire l’ADN dans une cellule
1) Le NOMBRE de cellules qui prendront l’ADN
2) Le niveau d’EXPRESSION du gène
3) L’expression dans le TEMPS
Expliquez le fonctionnement de la méthode physique
Il s’agit de faire pénétrer l’ADN à travers la membrane cellulaire par l’utilisation d’une force physique
Nommez 3 méthodes physiques
1) Microinjection
2) Électroporation
3) Biolistique
Expliquez le fonctionnement de la technique de microinjection
En utilisant une très petite aiguille de verre on injecte directement l’ADN dans la cellule
Nommez 2 équipements requis pour procéder à une microinjection
1) Microscope
2) Micromanipulateurs
Nommez 4 limitations de la technique de microinjection
1) Une seule cellule est injectée à la fois
2) Demande beaucoup de dextérité manuelle
3) L’ADN est incorporé de façon aléatoire dans le génome
4) Très difficile de microinjecter des neurones (Petit et fragile)
Expliquez le fonctionnement de la technique de l’électroporation
1) Application d’un champs électrique aux cellules
2) Formation de pores au niveau de la membrane celllulaire
3) L’ADN entre dans la cellule par les pores (Migre du - vers +)
4) Retrait du champs électrique lorsque l’ADN est à l’intérieur
Nommez 3 avantages de l’électroporation
1) Peut être utilisée in vitro, in vivo et in utero (Neurone adjacent aux ventricules)
2) Peut transfecter plusieurs TYPES cellulaires
3) Possible de VARIER le niveau d’expression du gène
Expliquez le fonctionnement de l’électroporation in utero
1) L’embryon est sorti de la mère
2) L’ADN est injecté dans les ventricules de l’embryon
3) Des électrodes en forme de palette produisent un champs électrique qui dirige l’ADN dans les cellules
4) L’embryon est replacé dans la mère
Vrai ou Faux
La période et la localisation de l’introduction de l’ADN peut être contrôlée en électroporation
Vrai
Par la période embryonnaire choisi et par position des électrodes. Ceci permet de dirigée l’expression dans des couches spécifiques
Comment peut-on faire varier le niveau d’expression du gène en électroporation
En variant la force et le pattern du champs électrique
Expliquez le fonctionnement de la technique de biolistique
1) Produire des particules de métaux lourds liées avec l’ADN
2) Charger les particules/ADN sur une balle en plastique
3) Augmentation puis libération de la pression d’air
4) Propulsion de la balle jusqu’à un filtre qui laisse seulement passer les particules/ADN
5) Les particules pénètre la membrane cellulaire avec L’ADN
Nommez 2 métaux lourds utilisé en biolistique
1) Tungsten
2) Or
Nommez 2 limitations de la biolistique
1) Pas in vivo (Il existe des exceptions)
2) Cause des dommages importants aux cellules
Nommez 2 avantages de la biolistique
1) Les cellules transfectées sont dispersées (burst)
=> Avantageux pour examiner la morphologie d’un neurone isolé
2) Fonctionne bien pour les tranche de cerveau (épais)
Expliquez le fonctionnement des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
1) ADN forme un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
2) Ces macro-complexes vont être endocyté ou fusionné avec la membrane cellulaire
Nommez 2 avantage des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
** Méthodes les plus couramment utilisées **
1) Très efficaces (Haut % de cellules transfectées)
2) Très simples à utiliser
Nommez 2 limitations des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
1) Pas in VIVO
2) Expression TRANSITOIRE (quelques jours)
Nommez les 2 principaux produits chimiques utilisé pour l’introduction de l’ADN
1) Phosphate de calcium
2) Lipides de transfection
Expliquez le fonctionnement de la transfection par lipides
1) Formation d’un liposome autour de l’ADN
2) Le liposome peut être endocyté ou se fusionner avec la membrane cellulaire
Qu’est-ce qu’un liposome
Une structure vésiculaire qui a la même composition que la membrane cellulaire
Expliquez le fonctionnement des vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
** Aka: Transduction **
1) Modification d’un virus pour qu’il ne puisse pas se multiplier tout seul dans la cellule
2) Le virus s’attache à une cellule et y injecte son ADN
Nommez 4 avantages aux vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
1) ROBUSTE
2) Très EFFICACE (Haut % de cellules infectées)
3) Expression à LONG terme
4) In vitro et in VIVO
Nommez 3 limites aux vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
1) L’expression n’est PAS IMMÉDIATE (1-2 semaines après)
2) La taille du vecteur viral limite la TAILLE de l’ADN inséré
3) Problème de BIOSÉCURITÉ
** Il existe des avantages / limites propres à chaque vecteur **
Expliquez le processus de production de virus
1) Insérer le gène d’intérêt dans un vecteur (vecteur NAVETTE)
2) CO-TRANSFECTION du vecteur navette avec le vecteur viral
- Effectuée dans les cellules HEK 293T
3) Les cellules produisent des particules virales dans le milieu 1-2 jours après la transfection
4) Prélever le milieu et centrifuger pour sédimenter
5) Resuspendre le culot dans un tampon ou congelé
Pourquoi la tranfection se fait dans les cellules HEK 293T
1) Elles prolifèrent RAPIDEMENT
2) Elles se transfectent FACILEMENT
3) Elles peuvent produire une grande QUANTITÉ de virus
Nommez 3 limites à l’Adénovirus pour l’introduction de l’ADN
1) ADN de 7.5 à 30 kb
2) L’ADN n’est pas intégré au génome
=>Expression TRANSITOIRE
3) Peut causer une réponse INFLAMMATOIRE / mort cellulaire
Nommez 1 avantages à l’Adénovirus pour l’introduction de l’ADN
1) Peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotique
Nommez 2 limites pour le virus Adéno-associé (AAV) pour l’introduction de l’ADN
1) Sa production est très laborieuse (=> très cher)
2) Il peut contenir des ADN de max 5 kb
Nommez 4 avantages pour le virus Adéno-associé (AAV) pour l’introduction de l’ADN
1) Plus SÉCURITAIRE (Besoin d’un helper pour se multiplier)
2) Il peut infecter les cellules mitotique et POST-mitotiques
3) Il peut s’intégrer dans le génome
=>Expression à LONG terme
4) Moins toxique
Nommez 1 avantage du lentivirus pour l’introduction de l’ADN
1) Expression à LONG terme
Nommez 1 limites pour le lentivirus pour l’introduction de l’ADN
1) Il peut contenir un ADN de max 8 kb
Classez les 3 virus suivant en ordre croissant de la taille de l’ADN qu’il peuvent insérer
1) Virus Adeno-associé (AAV) => Max 5kb
2) Lentivirus => 8kb
3) Adenovirus => 7.5 à 30kb
Expliquez le fonctionnement du lentivirus
1) La cellule endocytpse le lentivirus
2) Libération de la transcriptase inverse et de l’ARN du lentivirus
3) L’enzyme transcriptase inverse produit L’ADNc de l’ARN
4) L’ADNc migre au noyau et est intégré dans le génome
Nommez les 3 techniques les plus utilisé en culture cellulaire
1) Transfection chimique
2) Électroporation
3) Virus
Nommez les 2 techniques les plus utilisé en tranche decerveau
1) Virus
2) Biolistique
Nommez les 2 techniques les plus utilisé in vivo
1) Virus
2) Électroporation (principalement in utero)
Nommez les 2 techniques les plus utilisé pour des cellules individuelles
1) Microinjection
2) Electroporation
Expliquez les considérations à prendre lorsque l’environnement est un cerveau in vivo
Les cellules du cerveau ne fonctionnent pas bien avec la majorité des techniques de transfection (non-viral)
Expliquez les considérations à prendre lorsque l’environnement est une tranche de cerveau
- La technique doit permettre de transmettre rapidement et efficacement les gènes
- Il est possible que les gènes doivent traverser du tissu épais
Expliquez les considérations à prendre lorsque l’environnement est une culture de cellules
La technique doit être efficace et productive pour insérer l’ADN dans des milliers voir des millions de cellules
Expliquez les considérations à prendre lorsque l’environnement est une cellule individuelle
Dans ces cas, les cellules sont souvent précieuse donc l’efficacité est importante
Nommez 3 utilités aux cultures cellulaires
1) Étudier le rôle de gènes particuliers, de protéines ou de différents types cellulaires (Étude de fonction)
2) Co-culture et comment elles peuvent affecter leur comportement respectif
3) Manipulations pharmacologiques
Qu’est-ce qu’une co-culture et leur rôle
- Lorsque 2 types cellulaires sont cultivés ensemble
- Elles ont été beaucoup utilisées pour identifier les facteurs impliqués dans la pousse de l’axone des motoneurones
Expliquez la techniques de culture cellulaire
La culture cellulaire consiste à faire proliférer et à maintenir dans des conditions contrôlées des cellules qui ont été isolées d’un animal ou humain
Nommez 5 avantages aux techniques de culture cellulaire
1) SIMPLE: - Simplifie l’environnement
=> Réduit les intéractions avec d’autres organes
2) CONTRÔLABLE: - Conditions de l’environnement sont plus facile à controler
3) PARALLÈLE: - Permet de performer en parallèle plusieurs expériences avec un nombre exact de cellules
4) RAPIDE
5) CHEAP: Moins dispendieux (et moins d’animaux)
Nommez les 3 types cellulaires utilisés en culture
1) Lignées de cellules immortalisées
2) Culture primaire
3) Cellules souches
Nommez 3 questions soulevé par rapport à la culture cellulaire
1) Dans un pétri vs cerveau vs animal intact
2) Individuelle vs en réseau
3) Cellules immortalisées vs cellules post-mitotiques
=>Extrapoler les résultats avec prudence
Nommez 2 éléments nécessaire pour le milieu de culture
1) Alimentation en oxygène, nutriments, facteurs de croissance, etc
2) Prévention des contaminations (~Blood Brain Barrier)
Nommez 5 avantages des lignées cellulaires immortalisées
1) Elles peuvent se diviser rapidement et indéfiniment*
=>Grande quantité
2) Très bien caractérisées (très utilisées)
3) Homogènes en théorie
=> Résultats constants et reproductible
4) Plus facile à cultiver que les cellules primaires
5) Possibilité de les fusionnée à un tag (ex: fluorescence)
Nommez 2 limitations des cellules de lignées cellulaires immortalisées
1) Elles ne sont pas normales (Pattern de gènes pas in vivo)
=> Peut-être pas les fonction d’une cellule normale
2) Modification après une certaine période de prolifération continuelle
Nommez 2 lignées cellulaires immortalisées populaires et leur rôle
1) Lignée des cellules PC12
=> Étudier les mécanismes impliqués dans la différenciation neuronale
2) Lignées de neuroblastomes (ex: souris Neuro2A)
=> Étudier la fonction de protéines spécifiques aux neurones
Comment une lignées cellulaires immortalisées se transforme en neurone
On ajoute du NGF au milieu (Réversible)
Vrai ou Faux
Les neurones dérivant des lignées cellulaires immortalisées peuvent redevenir une cellule immortalisée
Vrai
La différenciation en neurone est réversible
Qu’est-ce que la culture primaire
Il s’agit d’une culture de tissu utilisant des tissus prélevés directement d’un animal
Nommez 2 rôles d’une culture primaire
ISOLER une population spécifique de cellules pour étudier:
1) la fonction / aspects d’un TYPE cellulaire (fonction des neurones)
2) les effets d’une modification GÉNÉTIQUE
Nommez 2 limites de la culture primaire
1) La survie est limitée
2) L’âge de l’animal (plus jeune => plus robuste) Max 4 semaines
Nommez 3 types de cultures primaires
1) Cultures dissociées
2) Explants
3) Cultures de tranches de tissu
Nommez 3 rôles de la culture de cellules dissociées
** Shoutout graziela **
1) Séparer les cellules individuellement
2) Étudier la pousse des neurites
3) Étudier la formation de synapses
Vrai ou Faux
Les neurones retiennent l’identité de la région de laquelle ils ont été isolés et deviendront mature
Vrai
Morphologie et les propriétés moléculaires et physiologiques
Vrai ou Faux
Les neurones dissociés peuvent être maintenus en vie pendant plusieurs jours
Vrai
Des semaines
Nommez 2 limitations des cultures de cellules dissociées
1) Perte de l’organisation et des connexions
2) Petite quantité de cellules
Nommez 2 méthodes pour isoler une population bien précise de cellules
1) Immunopanning
2) Cytométrie de flux
Expliquez la technique d’immunopanning
Un anticorps dirigé contre une protéine spécifique à un type cellulaire est attaché à la surface du pétri afin de capturer ces cellules
Qu’est-ce qu’une tranche aigue
Des tranches qui sont utilisées immédiatement pour des expériences d’électrophysiologie
Qu’est-ce qu’un tranche organotypique
Des tranches qui sont maintenues en culture pour plusieurs jours ou semaines (changements morphologiques)
Nommez 3 rôles aux tranches organotypiques
** Shoutout à graziela **
1) Étudier la migration neuronale
2) Formation de l’axone
3) Formation de synapses
Nommez 1 rôle des tranches aigues
Expérience d’électrophysiologie
Nommez 1 nécessité des cultures de tranche
Elles nécessite un interface air/liquide pour un échange gazeux approprié à travers la tranche
Nommez 1 avantage de la culture de tranches
Technique qui conservent la structure et l’organisation
Nommez 1 limite de la culture de tranches
Difficile d’avoir accès à des structures profondes in vivo
Qu’est-ce qu’une culture d’explants
Il s’agit d’une préparation intermédiaire en groupe cohérent (entre les cellules dissocies et les tranches)
Vrai ou Faux
Les cultures d’explants ont besoin d’un interface pour échange gazeux
Faux
Seulement les cultures en tranches ont besoin d’un interface
Nommez 2 rôles des cultures d’explants
** Souvent utilisés en co-culture **
1) Étudier la migration neuronale
2) Étudier la formation de neurites
Nommez 1 avantage et 1 inconvénient à la culture d’explants
Avantage:
=> Même composition cellulaire
Limite:
=> Organisation non-précise
Nommez 2 critères de classification des cellules souches
Classifiées selon
1) Leur source
2) Le tissu (Neural, hematopoïetique, peau)
Nommez 3 sources de cellules souches
1) Cellules souches embryonnaires
2) Cellules souches adultes
3) Cellules souches pluripotentes induites (iPSC)
Vrai ou Faux
Une cellule souche a la capacité de générer tous les types cellulaire de façon ilimitée
Vrai
Décrivez le milieu des cellules souches
Contient des facteurs de croissance:
1) EGF
2) bFGF
** Afin de préserver leur multipotence et leur capacité de se renouveler **
Les cellules souches embryonnaires sont dérivées de quoi
De la masse interne du blastocyste
Expliquez le processus de transformation des cellules souches en neurone
1) Induction en cellules progénitrices neurales
2) Ajout de morphogène pour les transformer en neurones
3) Examination de l’activation de facteurs de transcription impliqués dans le développement et de marqueurs connus
Vrai ou Faux
La production de cellules souches embryonnaires et leur différentiation en un type de neurones peut prendre beaucoup de temps
Vrai
Peut prendre plusieurs mois
Vrai ou Faux
La production de cellule souche est hétérogène
Vrai
Elle peut l’être
Vrai ou Faux
Le cerveau d’embryons contient plusieurs cellules souches neurales alors que le cerveau adulte en contient peu
Vrai
La capacité des cellules souches neurales à produire des neurones diminue grandement avec l’âge
Expliquez les étapes du prélévement des cellules souches neurales
1) Isolement / dissection des cellules souches neurales
2) Centrifugation
3) Prolifération dans le milieu de culture
4) Retrait des facteurs de croissance du milieu
Que ce produit-il lorsque les cellules souches neurales sont cultivées en conditions non-adhérentes (en suspension)
Elles forment des neurosphères (boules de cellules en division)
Qu’est-ce qu’une cellule souche pluripotente induite
Il s’agit de cellules différenciées qui ont été manipulées afin de les ramener au stade de cellules souches
Nommez 2 exemples de cellules souches pluripotentes induites
1) PBMC
2) Fibroblastes de la peau
Expliquez le processus de production des cellules souches pluripotentes induites
1) Introduction des 4 facteurs de transcription spécifiques avec des virus
2) Testes de vérification
A) Examine le profil des facteurs de transcription et la présence de marqueurs (immunocytochimie et RT-PCR)
B) Différenciation forcée en 1 type cellulaire précis
Quelle technique permettra peut-être un jour de remplacer les neurones d’un patient Alzheimer grâce à ces propre cellules
La culture des cellules souches pluripotentes induites
