Cours 8 - Culture de Gène Flashcards
Nommez 3 utilités à introduire un gène dans une cellule
1) Souris transgénique pour étudier la FONCTION d’un gène
2) Étudier les CONSÉQUENCES d’une mutation d’un gène sur le fonctionnement d’une cellule
3) Examiner COMMENT un gène contrôle l’expression d’autres gènes
Nommez 3 catégories de stratégies pour introduire l’ADN
1) Force physique (Billes d’or)
2) Produits chimiques (Liposomes)
3) Vecteurs viraux
Qu’est-ce que la transfection
Fait référence à une méthode non-virale pour introduire de l’ADN dans une cellule
Qu’est-ce que la transduction
Implique que l’ADN est introduit par un vecteur viral (Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN)
Nommez les 3 facteurs qui déterminent la selection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule
1) L’environnement cellulaire (in vivo vs vitro)
2) Type cellulaire
3) Le but de l’expérience
Vrai ou Faux
La force physique est une bonne stratégie pour introduire l’ADN dans un neurone
Faux
Les neurones sont trop fragiles
Nommez les 3 caractéristiques importantes pour les stratégies pour introduire l’ADN dans une cellule
1) Le NOMBRE de cellules qui prendront l’ADN
2) Le niveau d’EXPRESSION du gène
3) L’expression dans le TEMPS
Expliquez le fonctionnement de la méthode physique
Il s’agit de faire pénétrer l’ADN à travers la membrane cellulaire par l’utilisation d’une force physique
Nommez 3 méthodes physiques
1) Microinjection
2) Électroporation
3) Biolistique
Expliquez le fonctionnement de la technique de microinjection
En utilisant une très petite aiguille de verre on injecte directement l’ADN dans la cellule
Nommez 2 équipements requis pour procéder à une microinjection
1) Microscope
2) Micromanipulateurs
Nommez 4 limitations de la technique de microinjection
1) Une seule cellule est injectée à la fois
2) Demande beaucoup de dextérité manuelle
3) L’ADN est incorporé de façon aléatoire dans le génome
4) Très difficile de microinjecter des neurones (Petit et fragile)
Expliquez le fonctionnement de la technique de l’électroporation
1) Application d’un champs électrique aux cellules
2) Formation de pores au niveau de la membrane celllulaire
3) L’ADN entre dans la cellule par les pores (Migre du - vers +)
4) Retrait du champs électrique lorsque l’ADN est à l’intérieur
Nommez 3 avantages de l’électroporation
1) Peut être utilisée in vitro, in vivo et in utero (Neurone adjacent aux ventricules)
2) Peut transfecter plusieurs TYPES cellulaires
3) Possible de VARIER le niveau d’expression du gène
Expliquez le fonctionnement de l’électroporation in utero
1) L’embryon est sorti de la mère
2) L’ADN est injecté dans les ventricules de l’embryon
3) Des électrodes en forme de palette produisent un champs électrique qui dirige l’ADN dans les cellules
4) L’embryon est replacé dans la mère
Vrai ou Faux
La période et la localisation de l’introduction de l’ADN peut être contrôlée en électroporation
Vrai
Par la période embryonnaire choisi et par position des électrodes. Ceci permet de dirigée l’expression dans des couches spécifiques
Comment peut-on faire varier le niveau d’expression du gène en électroporation
En variant la force et le pattern du champs électrique
Expliquez le fonctionnement de la technique de biolistique
1) Produire des particules de métaux lourds liées avec l’ADN
2) Charger les particules/ADN sur une balle en plastique
3) Augmentation puis libération de la pression d’air
4) Propulsion de la balle jusqu’à un filtre qui laisse seulement passer les particules/ADN
5) Les particules pénètre la membrane cellulaire avec L’ADN
Nommez 2 métaux lourds utilisé en biolistique
1) Tungsten
2) Or
Nommez 2 limitations de la biolistique
1) Pas in vivo (Il existe des exceptions)
2) Cause des dommages importants aux cellules
Nommez 2 avantages de la biolistique
1) Les cellules transfectées sont dispersées (burst)
=> Avantageux pour examiner la morphologie d’un neurone isolé
2) Fonctionne bien pour les tranche de cerveau (épais)
Expliquez le fonctionnement des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
1) ADN forme un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
2) Ces macro-complexes vont être endocyté ou fusionné avec la membrane cellulaire
Nommez 2 avantage des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
** Méthodes les plus couramment utilisées **
1) Très efficaces (Haut % de cellules transfectées)
2) Très simples à utiliser
Nommez 2 limitations des méthodes chimiques pour l’introduction de l’ADN
1) Pas in VIVO
2) Expression TRANSITOIRE (quelques jours)
Nommez les 2 principaux produits chimiques utilisé pour l’introduction de l’ADN
1) Phosphate de calcium
2) Lipides de transfection
Expliquez le fonctionnement de la transfection par lipides
1) Formation d’un liposome autour de l’ADN
2) Le liposome peut être endocyté ou se fusionner avec la membrane cellulaire
Qu’est-ce qu’un liposome
Une structure vésiculaire qui a la même composition que la membrane cellulaire
Expliquez le fonctionnement des vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
** Aka: Transduction **
1) Modification d’un virus pour qu’il ne puisse pas se multiplier tout seul dans la cellule
2) Le virus s’attache à une cellule et y injecte son ADN
Nommez 4 avantages aux vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
1) ROBUSTE
2) Très EFFICACE (Haut % de cellules infectées)
3) Expression à LONG terme
4) In vitro et in VIVO
Nommez 3 limites aux vecteurs viraux pour l’introduction de l’ADN
1) L’expression n’est PAS IMMÉDIATE (1-2 semaines après)
2) La taille du vecteur viral limite la TAILLE de l’ADN inséré
3) Problème de BIOSÉCURITÉ
** Il existe des avantages / limites propres à chaque vecteur **
Expliquez le processus de production de virus
1) Insérer le gène d’intérêt dans un vecteur (vecteur NAVETTE)
2) CO-TRANSFECTION du vecteur navette avec le vecteur viral
- Effectuée dans les cellules HEK 293T
3) Les cellules produisent des particules virales dans le milieu 1-2 jours après la transfection
4) Prélever le milieu et centrifuger pour sédimenter
5) Resuspendre le culot dans un tampon ou congelé
Pourquoi la tranfection se fait dans les cellules HEK 293T
1) Elles prolifèrent RAPIDEMENT
2) Elles se transfectent FACILEMENT
3) Elles peuvent produire une grande QUANTITÉ de virus
Nommez 3 limites à l’Adénovirus pour l’introduction de l’ADN
1) ADN de 7.5 à 30 kb
2) L’ADN n’est pas intégré au génome
=>Expression TRANSITOIRE
3) Peut causer une réponse INFLAMMATOIRE / mort cellulaire
Nommez 1 avantages à l’Adénovirus pour l’introduction de l’ADN
1) Peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotique
Nommez 2 limites pour le virus Adéno-associé (AAV) pour l’introduction de l’ADN
1) Sa production est très laborieuse (=> très cher)
2) Il peut contenir des ADN de max 5 kb
Nommez 4 avantages pour le virus Adéno-associé (AAV) pour l’introduction de l’ADN
1) Plus SÉCURITAIRE (Besoin d’un helper pour se multiplier)
2) Il peut infecter les cellules mitotique et POST-mitotiques
3) Il peut s’intégrer dans le génome
=>Expression à LONG terme
4) Moins toxique
Nommez 1 avantage du lentivirus pour l’introduction de l’ADN
1) Expression à LONG terme
Nommez 1 limites pour le lentivirus pour l’introduction de l’ADN
1) Il peut contenir un ADN de max 8 kb