Cours 7 - Microscopie Flashcards
Qu’est-ce que le pouvoir de résolution
la plus petite distance entre deux points pouvant être distinguée par un microscope.
Vrai ou Faux
Le grossissement d’un objet n’améliore pas nécessairement la résolution de l’image
Vrai
Qu’est-ce que la limite de résolution
La distance minimale pour distingués 2 points
Formule de la résolution
r = 1.22λ / 2*ON
R = Résolution
λ = La longueur d’onde de la lumière qu’on utilise pour illuminer l’échantillon
ON = Ouverture numérique
Vrai ou Faux
Plus r est grand, mieux est la résolution
Faux
C’est l’inverse
Vrai ou Faux
Plus on augmente le grossissement, plus on augmente la résolution
Faux
Pas nécessairement
Des longueurs d’ondes plus longue (Rouge) donnent une résolution plus _______
Faible
Qu’est-ce que le spectre visible
AKA: Spectre lumineux ou optique
- La partie du spectre électromagnétique qui est visible pour l’oeil humain
La formule de l’ouverture numérique
ON = n x sin(α)
n = Indice de réfraction du milieu
α = Angle auquel la lumière pénètre l’objectif du microscope
Qu’est-ce que l’indice de réfraction
Les changements de vitesse de la lumière pendant sa propagation à travers d’un milieu (1 = vide; 1.33 = air)
Un objectif avec une ON supérieure conduit à une puissance de résolution ___________
Permettra de recueillir plus de rayons lumineux
=> Meilleur résolution
Nommez une limitation de la microscopie optique
Elle est limité par la diffraction de la lumière
- Spectre visuel min = ~400 nm
- On moyenne = ~1
Nommez 2 méthodes pour éviter les limitations de la microscopie optique
1) Utiliser des longueurs d’ondes hors le spectrum de lumière visible (microscope électronique: faisceau de particules d’électrons)
2) Modifier le patron de diffraction de la lumière (Microscopie STED)
Nommez 2 type de microscopes selon la formation de l’image
1) Simple
2) Composé
Nommez 1 différence entre la microscopie simple et composé
Simple:
- Une seule lentille
Composé:
- Plusieurs lentilles
Nommez un avantage de la microscopie composé
Augmente le grossissement
Nommez 1 exemple de microscopie simple
Une loupe
Lentille de l’objectif vs lentille oculaire
Lentille de l’objectif:
=> Proche a l’échantillon
Lentille oculaire:
=> Proche de l’oeil
Nommez 3 composants d’un microscope composé
1) La lentille de l’objectif
2) Le condensateur
3) La lentille oculaire
Quel est le rôle d’un condensateur dans un microscope composé
Focalise la lumière de la source sur l’échantillon
Nommez 4 types de modalités de microscopie optique
1) Microscopie en champ CLAIR
2) Microscopie à contraste de PHASE
3) Microscopie en champ SOMBRE
4) Microscope à contraste interférentiel ou Nomarski
Nommez 4 types de microscopie à fluorescence
1) Microscopie à fluorescence STANDARD (epifluorescence)
2) Microscopie à fluorescence CONFOCALE
3) Microscopie à deux-photons (multiphotonique)
4) Microscopie STED (déplétion par émission stimulée)
Qu’est-ce qu’un fluorophore
Substance chimique capable d’émettre de la fluorescence après excitation par la lumière
Nommez 4 avantages de la microscopie à fluorescence en général
1) DÉTECTER des molécules marquée a la fluorescence
2) PLUSIEURS fluorophores simultanément
3) Très bon RAPPORT signal/bruit
4) Très SENSIBLE, permet la détection de molécules en faible quantité
Nommez 1 rôle associé à la fluorescence standard
Acquisition des images relativement simple (par rapport a la microscopie confocale ou multi-photonique).
Nommez 4 limitations de la microscopie à fluorescence standard
1) Photoblanchiment (La lumière émise par le fluorophore diminue avec le temps)
2) Phototoxicité (Peut causer la mort cellulaire)
3) Le bruit de fond peut être élevé a cause de la fluorescence non spécifique ou l’autofluorescence du tissue
4) Il faut que l’objet soit dans le plan focal du système optique
=>Problématique pour les objets épais
Expliquez le fonctionnement d’un microscope confocale
1) Utilise une illumination focalisée sur un point dans un PROFONDEUR SPÉCIFIQUE de l’échantillon (plan focal) a différents niveaux de profondeur
2) Réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation 3D de l’objet (z-stacks) (recomposée par l’ordinateur)
=> Image 3D
Expliquez le fonctionnement d’un microscope à fluorescence standard
1) Lumière passe à travers le filtre d’excitation
2) Lumière absorbée par les fluorophores causant leur excitation
3) Émission d’une lumière (λ plus longue)
4) La lumière émise est capturée par l’Objectif
5) Filtre d’émission
6) Détection (Oeil ou caméra)
Nommez 3 avantages de la microscopie confocale
1) Images extrêmement nettes
2) Seules les images dans le plan focal sont ramassées
3) => Permet l’imagerie des échantillons plus épais
Nommez 2 limitations de la microscopie confocale
1) Le balayage requière une illumination des échantillons a LONG-terme (=> Augmente le photoblanchiment)
2) Processus LENT (=> Difficile de visualiser des évènements rapides)
Nommez 3 avantages du microscope à 2-photons
1) La fluorescence est localisée sur un PLAN focal très étroit
=> Réduit grandement le photoblanchiment
=> Images plus claires (Bruit de fond très bas)
2) Permet la visualisation des cellules ou structures plus PROFONDES
3) La longueur d’onde de la lumière excitatrice est typiquement dans le proche INFRA-ROUGE
=>Rentrant plus facilement dans le tissu sans phototoxicité
Nommez 1 limitation du microscope à 2-photons
Nécessite des équipements spécialisés et couteux (> 1M$)
Nommez 1 avantage de la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)
Super résolution
Expliquez le fonctionnement de la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)
Il se sert de deux rayons laser:
Rayon 1) Excite les bornes fluorescentes
=> Forme un point
Rayon 2) Pour l’épuisement (Désactivation sélective)
=> Forme un beignet
Nommez 2 limitations de la microscopie électronique
1) Échantillons PRÉPARÉS
- Les échantillons sont fixés, déshydratés et traités avec des agents chimiques
=> Peu de chance de visualiser des cellules vivantes
2) Présence des ARTEFACTS visuels causé par le traitement du tissue
Qu’est-ce que le grossissement
Il réfère à combien de fois l’échantillon appraraît plus grand par rapport à sa taille réelle
Nommez 2 principes essentiel en microscopie
1) Le grossissement
2) La résolution
Expliquez le fonctionnement de la microscopie à fluorescence
Technique utilisant un microscope optique COMPOSÉ équipé d’un émetteur à laser qui permet la sélection d’une longueur d’onde précise
Nommez 1 rôle des fluorophores
Ils peuvent être couplés aux protéines, ac. ou d’autres sondes pour visualiser des molécules et structures dans une cellule
Vrai ou Faux
Il est possible de combiner des fluorophores en microscopie à fluorescence
Vrai
Ils faut choisir des molécules avec des spectres d’excitation et émission différents
Pour qu’une image soit nette en microscopie à la fluorescence standard, il faut que ____________________________
Que l’objet soit dans le plan focal du système optique
** Ceci cause problème quand l’objet est épais **
Expliquez pourquoi la microscopie à fluorescence standard n’est pas idéal pour les objets épais
Car quand l’objet est épais la lumière émise par le plan focal (nette) est perdu dans la fluorescence émise par les plans adjacents (flou)
Qu’est-ce que le microscope à 2 photons
Il s’agit d’une variation plus sophistiquée de la microscopie à fluorescence: - Le fluorophore est excité en absorbant 2 photons simultanément (évènement rare)
Qu’est-ce que le photoblanchissement
La diminution de la lumière émise par le fluorophore avec le temps
Expliquez le fonctionnement du microscope électronique
1) Un faisceau de particule d’électrons illumine l’échantillon
2) La projection de l’objet créer une image très agrandie
Quelle technique de microscopie permet l’observation des plus petites structures du système nerveux comme la synapse
Le microscope électronique
