Cours 10 - Visualisation Fonctionnelle Flashcards
Nommez 3 techniques pour visualiser l’activité neuronale
1) Expression de gènes précoces immédiats
2) Prolifération cellulaire (BrdU)
3) Marqueurs sensible au voltage et calcium
Nommez 2 techniques non-électrophysiologiques pour
visualiser et manipuler l’activité du cerveau
1) Libération de molécules « uncaging »
2) Canaux activés par la lumière
Nommez 2 approches des marqueurs statiques de l’activité
1) Observer indirectement la présence d’activité en mesurant des PRODUITS (durant ou après)
2) Incorporer un marqueur dans les cellules qui indique la présence d’activité dans des futures examens HISTOLOGIQUES
Nommez le(s) limitation(s) des marqueurs statiques de l’activité
1) On observe l’activité à un moment bien défini (arrêt sur image: « snapshot ») d’un processus dynamique
Nommez 2 méthodes histologiques pour détecter les IEGs
1) Hybridation in situ
2) Immunohistochimie (Direct et Indirect)
Qu’est-ce qu’un IEG
Gène précoces immédiates
Vrai ou Faux
Les IEGs sont un produit induit lentement par l’activité neuronale
Faux
L’activité neuronale induit rapidement (quelques minutes) la
transcription transitoire des IEGs
Les IEGs encodent pour quoi
** Protéine jouant un rôle dans la plasticité neuronale **
1) Facteurs de transcription (c-fos, c-myc et c-jun)
2) Protéines interagissant avec le cytosquelette (Arc)
3) Facteurs de croissance (BDNF)
Qu’est-ce que BDNF
Il s’agit d’un facteur de croissance (Brain derived neurotrophic factor)
Qu’est-ce que Arc
Il s’agit d’une protéine interagissant avec le cytosquelette
Qu’est-ce que le Allen Brain Atlas
Il s’agit d’un site internet qui donne beaucoup d’information sur les protéines / gènes d’intérêt
Que signifie IHC
Immunohistochimie
Que signifie ISH
Hybridation in situ
Vrai ou Faux
Il existe 2 types d’immunohistochimie
Vrai
Direct et indirect
L’immunoréactivité (IHC) de __________ comme marqueur de l’activité dans l’activité dans le cortex visuel
c-Fox
** Utile aussi en ISH **
Nommez le(s) limitation(s) de l’immunoréactivé de c-Fos comme marqueur de l’activité dans le cortex visuel
1) Tissu est FIXÉ donc ne représente pas la vraie activité neuronale.
2) Marqueurs STATIQUES ne représente pas la continuité ou la dynamique des changements « snapshot ».
3) Nécessité de faire des études ADDITIONNELLES pour démontrer que les changements observés sont pertinents
Qu’est-ce que le BrdU
Aka: - Bromodeoxyuride
Il s’agit d’un nucléoside synthétique analogue de la thymine
Nommez 1 rôle de BrdU
Détecter la prolifération cellulaire dans des tissus vivants (Les cellules qui sont en train de répliquer l’ADN vont
intégrer le BrdU dans leur ADN)
Expliquez la méthode de marquage au BrdU
1) Incorporation / fixation de BrdU à l’ADN
2) Dénaturation de l’ADN
3) Liaison des anticorps anti-BrdU
4) Anticorps associés avec une molécule fluorescente
** Contrôle positif => DAPI **
Expliquez la signification des expériences de Fernando Nottebohm
Elles fournissent la preuve finale que la neurogenèse se produit dans le cerveau adulte des vertébrés
Quelle technique a permis à Fernando de prouver la neurogenèse dans le cerveau adulte des vertébrés
La méthode de marquage au BrdU
Que signifie HVC
High Vocal Center
Expliquez les expériences de Fernando Nottebohm
1) Injections de BrdU pendant 5 jours
2) Oiseaux libres de chanter pendant le reste du mois**
3) Un groupe a été stimulé à chanter et un groupe a été empêcher (Pendant 1 semaine)
4) Examens histologiques
** L’hippocampe a été utilisé comme contrôle **
Décrivez les résultats de l’expérience de Fernando Nottebohm
Le nombre de neurones marqués par BrdUrd dans le HVC du groupe chanteur été significativement plus élevé que celui du groupe non chanteur (P < 0,005)
Nommez le(s) limitation(s) des enregistrements électrophysiologiques
1) Pas pratique pour mesurer la réponse d’un grand nombre de neurones simultanément.
Qu’est-ce qu’un marqueurs sensibles au voltage
Il s’agit de fluorophores qui changent leur capacité d’absorption / émission dépendant du potentiel de membrane du neurone
Vrai ou Faux
Il existe un grand nombre de marqueurs sensible au voltage
Vrai
Avec différents propriétés de duration du signal, bruit de fond et toxicité
Nommez le(s) limitation(s) des MSV
1) BRUIT de fond élevé (faible rapport signal/bruit)
2) Pas de SPÉCIFICITÉ pour les différents types de neurones
3) Faible DURÉE d’action
=>Difficulté pour l’imagerie a long-terme (jours/weeks)
** Ces problèmes ont incité la création de MSV génétiquement encodés **
Que signifie MSV
Marqueurs sensibles au voltage
Vrai ou Faux
La dynamique du mouvement de calcium entrant ou sortant de la cellule peut être utilisé comme indicateur indirect de l’activité neuronale
Vrai
Ainsi que le calcium intracellulaire
Nommez 2 exmples d’indicateurs à calcium fluorescents
1) Marqueurs organiques dont la fluorescence augmente en se liant au calcium (ex. Fura-2, Fluo-4)
2) GCaMP (senseurs génétiquement encodés)
Vrai ou Faux
Le calcium est important
Vrai
Nommez 1 marqueur ratiométrique
Fura-2
Nommez 2 marqueurs non-ratiométrique
1) Fluo-4
2) GCaMP6
Comment est réalisée la mesure du calcium pour les marqueurs ratiométriques
1) 2 lasers à excitation (Pour les indicateurs à double excitation)
2) Deux plages de détection (Pour les indicateurs à double émission)
Expliquez le fonctionnement des marqueurs ratiométriques
Basés sur l’utilisation d’un rapport entre 2 intensités de fluorescence (Libre vs lié au calcium)
=>Indicateurs à double émission ou double excitation
Nommez le(s) avantage(s) des marqueurs ratiométriques
1) L’utilisation du ratio 340/380 nm annule automatiquement les variables (ex. bruit de fond, marqueur, épaisseur des cellules, etc.)
Nommez le(s) limitation(s) des marqueurs ratiométriques
1) Acquisition /manipulation des données plus COMPLEXE
2) MICROSCOPE à 2 longueurs d’ondes d’excitation/émission
3) Impossible de CIBLER des populations spécifiques de neurones
Nommez le(s) avantage(s) des marqueurs non-ratiométriques
1) Utilisation simple
2) Quantification simple
Nommez le(s) limitation(s) des marqueurs non-ratiométriques
1) Impossible de CIBLER des populations spécifiques de neurones
2) Les marqueurs peuvent CHANGER l’homéostasie calcique (en liant le calcium intracellulaire)
Expliquez le fonctionnement des marqueurs non-ratiométriques
Ils démontrent une relation directe entre les changement de la CONCENTRATION du calcium et l’INTENSITÉ de la fluorescence émise
Vrai ou Faux
La lumière émise par Fura-2 varie en fonction du calcium
Faux
** Marqueurs à double excitation (Pas double émission) **
Lumière émise = 510nm
Lumière excitatrice = 340-380nm selon la liaison au calcium
Vrai ou Faux
Il existe plusieurs marqueur Fluo
Vrai
Fluo-2, 3, 4, 8
Nommez 2 caractéristiques de GCaMP
1) Marqueur génétiquement encodé (Fusion de 3 protéines)
2) Marqueur non-ratiométrique
Décrivez la structure de GCaMP
Fusion de 3 protéines
1) GFP
2) Calmoduline (CaM)
3) M13 (Peptide synthétique sensible au changement de conformation)
Nommez 1 rôle de GCaMP
** Marqueur sensible au calcium **
Permet de mesurer directement les changements d’INTENSITÉ de fluorescence causés par un changement de CONFORMATION sensible au calcium (indicateur non-ratiométrique)
Nommez le(s) avantage(s) des senseurs de calcium génétiquement encodés
1) SPÉCIFICITÉ du ciblage (promoteur spécifique)
2) Haute SENSITIVITÉ
3) Analyse relativement FACILE
Nommez le(s) limitation(s) des senseurs de calcium génétiquement encodés
1) Faible résolution TEMPORELLE (GCaMP6/8 sont meilleurs)
2) Pourrait ALTÉRER les voies de signalisation calcique
Nommez le(s) avantage(s) de manipulation optique de l’activité neuronale
1) Permet de cibler de sous-types de neurones (ciblage génétique)
2) Permet de cibler une LARGE population neuronale
3) Diminue les EFFETS non-spécifiques (vs stim. électrique)
Nommez 2 méthodes optiques pour observer l’activité neuronale
1) Stimulation par la libération des molécules (« uncaging »)
2) Canaux activés par la lumière (Optogénétique)
** Permet aussi de stimuler ou inhiber l’activité neuronale **
Quelles techniques permettent de manipuler l’activité neuronale
Les méthodes optiques
Expliquez le fonctionnement des molécules encagées
1) Ajout d’un groupe chimique chimique protecteur (Cage) qui permet de bloquer l’activité de la molécule d’intérêt
2) Application d’une lumière spécifique
3) Libération de la molécules d’intérêt
Vrai ou Faux
Le composé encagé ne possède pas les propriétés actives du composé seul
Vrai
Nommez 1 utilité de la technique d’uncaging
Permet la libération hautement localisée de NT (Glutamate)
Nommez 2 opsines
1) Channelrhodopsine-2 (ChR2)
=>Excitation
2) Halorhodopsine (NpHR)
=>Inhibition
Nommez 1 rôle de l’optogénétique ciblé
Sonder le code neural dans un circuit cortical
Vrai ou Faux
GCaMP peut être utilisé dans plusieurs types cellulaires
Vrai
Photorécepteurs, cellules horizontales, bipolaires, ganglionnaires, amacrines, etc.
Nommez les 2 GCaMP les plus utilisés en neurosciences
GCaMP6
GCaMP8
Vrai ou Faux
Les GCaMP sont récente
Relativement (2004)
- Il existe plusieurs nouvelles version depuis
Vrai ou Faux
Le changement de fluorescence est une bonne représentation du PA
Vrai
Excellente représentation (même comparé avec l’électrophysiologie)
Nommez 1 avantage des marqueurs sensibles au voltage
1) Fine résolution temporelle des changements membranaires
