Cours 7 - Identification molécules Flashcards
Pourquoi la spectrophotométrie est-elle essentielle en biologie ?
Elle permet de détecter et quantifier des biomolécules comme l’ADN, l’ARN et les protéines.
Quels sont les défis de la détection de biomolécules ?
Les molécules peuvent être présentes en très faibles concentrations, nécessitant des méthodes sensibles et spécifiques.
Pourquoi utilise-t-on des ondes électromagnétiques en spectrophotométrie ?
Car elles interagissent différemment avec les molécules selon leur énergie, permettant d’identifier des composés spécifiques.
Quel est le principe général de la spectrophotométrie ?
Une lumière d’intensité I_0 traverse une solution, une partie est absorbée et l’intensité transmise I_t est mesurée.
Qu’est-ce que le spectre d’absorption ?
C’est la « signature » d’une molécule qui indique quelles longueurs d’onde elle absorbe préférentiellement.
Pourquoi chaque molécule a-t-elle un spectre d’absorption unique ?
Parce que ses liaisons chimiques et sa structure électronique déterminent comment elle interagit avec la lumière.
Pourquoi l’absorbance est-elle proportionnelle à la concentration ?
Parce que plus une solution contient de molécules absorbantes, plus elle atténue la lumière incidente.
Que se passe-t-il si la concentration est trop élevée ?
Il y a saturation du signal, ce qui fausse la relation linéaire de la loi de Beer-Lambert.
Quels sont les composants d’un spectrophotomètre ?
- Source lumineuse (ex. lampe au tungstène ou au deutérium)
- Monochromateur (sélectionne une longueur d’onde spécifique)
- Cuvette contenant l’échantillon
- Détecteur qui mesure la lumière transmise
Quels sont les types de spectrophotomètres ?
- Spectrophotomètre classique : analyse un échantillon à la fois
- Lecteur de plaques : analyse plusieurs échantillons en parallèle
- Nanodrop : utilise de très petits volumes (1-2 µL)
Pourquoi la densité optique (DO) est-elle utilisée pour estimer la concentration cellulaire ?
Les cellules ne n’absorbent pas la lumière mais la dévient, ce qui diminue l’intensité mesurée.
Quelle longueur d’onde est couramment utilisée pour mesurer la croissance bactérienne ?
600 nm (DO600), car elle minimise les interférences.
Quels sont les avantages et inconvénients de cette méthode ?
✔ Rapide, non destructif, peu coûteux
❌ Ne différencie pas cellules mortes et vivantes
Pourquoi les protéines absorbent-elles dans l’UV (200-400 nm) ?
- Liaison peptidique (~200 nm)
- Acides aminés aromatiques et doubles liens (tyrosine, tryptophane) (~280 nm)
Pourquoi utilise-t-on 280 nm pour estimer la concentration des protéines ?
Car la majorité des protéines contiennent des acides aminés aromatiques qui absorbent à cette longueur d’onde.
Quels sont les biais du dosage à 280 nm ?
La mesure dépend de la quantité d’acides aminés aromatiques, ce qui peut sous- ou surestimer la concentration.
Quelle est une alternative plus spécifique au dosage à 280 nm ?
Méthode de Bradford : utilise un colorant (Bleu de Coomassie) qui change d’absorption lorsqu’il se lie aux protéines.
Quelle est la longueur d’onde d’absorption des acides nucléiques ?
260 nm, car les bases azotées contiennent des doubles liaisons absorbantes.
Comment estime-t-on la pureté d’un échantillon d’ADN ou ARN ?
En mesurant le ratio A260/A280 :
- ADN pur : >1.8
- ARN pur : >2.0
- Ratio faible = contamination par des protéines
Quelle équation permet de corriger la contamination croisée entre ADN et protéines ?
Équation de Warburg & Christian
- Protéine (mg/mL) = 1.55A280 – 0.76A260
- Acide nucléique (mg/mL) = 0.0629A260 - 0.036A280
Qu’est-ce que la fluorescence ?
C’est l’émission de lumière par une molécule après absorption d’un photon d’énergie plus élevée.
Quelle est la différence entre fluorescence et phosphorescence ?
- Fluorescence : émission rapide (10⁻⁸ sec), cesse quand l’excitation s’arrête
- Phosphorescence : émission retardée, continue après excitation
Pourquoi la fluorescence est-elle plus spécifique que l’absorbance ?
Car elle repose sur deux filtres (excitation + émission), réduisant les interférences.
Qu’est-ce que la chimiluminescence ?
C’est la production de lumière via une réaction chimique.
