Cours 6 - Électrophorèse Flashcards
Quel est le principe général de l’électrophorèse ?
L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules (protéines, acides nucléiques) sous l’action d’un champ électrique. La migration dépend de la taille, de la charge, de la forme des molécules, de la puissance du champ, du pH et de la matrice utilisée.
Quels sont les principaux types d’électrophorèse ?
- Électrophorèse sur gel d’agarose
- Électrophorèse sur gel d’acrylamide (SDS-PAGE ou native)
- Immunobuvardage de type Western blot
- Électrofocalisation
À quoi sert l’électrophorèse sur gel d’agarose ?
Elle est principalement utilisée pour séparer les acides nucléiques (ADN et ARN) selon leur taille. Elle peut être analytique ou utilisée pour la purification.
Quelles sont les étapes principales de l’électrophorèse sur gel d’agarose ?
- Préparation du gel
- Dépôt des échantillons
- Migration
- Révélation
Comment la concentration d’agarose influence-t-elle la séparation ?
- Faible concentration → séparation de grosses molécules
- Forte concentration → séparation de petites molécules
Pourquoi utilise-t-on une solution de chargement ?
Elle contient des composants comme le glycérol ou le sucrose pour alourdir l’échantillon et faciliter son dépôt dans les puits. Elle inclut aussi des colorants pour suivre la migration.
Quels sont les tampons les plus utilisés pour la migration d’ADN et pourquoi ?
- TAE (Tris-acétate-EDTA)
- TBE (Tris-borate-EDTA)
Le pH (8.0) maintient la charge négative des acides nucléiques, ce qui favorise leur migration vers l’électrode positive.
Quels colorants sont utilisés pour révéler l’ADN après migration ?
- Bromure d’éthidium (intercalant, visible sous UV)
- SYBR-Safe, Safe-T-stain, Gel-Red (alternatives moins toxiques)
Quelle est la principale différence entre un gel d’agarose et un gel d’acrylamide ?
- Gel d’agarose : utilisé pour les acides nucléiques
- Gel d’acrylamide : utilisé pour les protéines (avec ou sans dénaturation)
Pourquoi utilise-t-on le SDS dans SDS-PAGE ?
Le SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) dénature les protéines et leur confère une charge négative uniforme, permettant une séparation selon la taille uniquement.
Quel est le rôle du β-mercaptoéthanol dans SDS-PAGE ?
Il réduit les ponts disulfures, séparant les sous-unités des protéines pour les linéariser.
Quels sont les rôles du bleu de Coomassie et du Ponceau S ?
- Bleu de Coomassie : colore les protéines après migration (liaison aux acides aminés aromatiques et basiques).
- Ponceau S : utilisé pour vérifier le transfert des protéines sur membrane en Western blot.
Quelle est la différence entre SDS-PAGE et Western blot ?
SDS-PAGE sépare les protéines, alors que le Western blot permet d’identifier une protéine spécifique via des anticorps après transfert sur membrane.
Pourquoi utilise-t-on du lait en poudre ou de la BSA en Western blot ?
Ils bloquent les sites non spécifiques sur la membrane pour éviter des faux positifs lors de la détection.
Quel est le principe de l’électrofocalisation ?
Les protéines migrent dans un gradient de pH jusqu’à atteindre leur point isoélectrique (pI), où leur charge nette est nulle.
Pourquoi l’électrofocalisation est-elle plus sensible que SDS-PAGE ?
Elle permet de séparer des protéines de masses similaires mais de pI différents.
