Cours 3 - Techniques de séparation des molécules I : Centrifugation et précipitation Flashcards
Qu’est-ce que le principe de centrifugation?
C’est quand une particule est soumise à une force dans un tube tourné à une certaine vitesse
Quels facteurs influent sur la force de centrifugation?
- la masse de la particule
- la vitesse angulaire (radian par sec)
- le rayon de la particule par rapport au centre du cercle
Comment exprime t-on la vitesse d’une centrifugation?
RPM
Comment exprime t-on la force de centrifugation relative (RCF) ?
En «g»
Que signifie RPM et comment varie t-il?
Révolution par minute (vitesse) et ça varie selon le modèle de centrifugeuse et le type de rotor
Qu’est-ce que la RCF?
La force qui s’exerce sur une particule en rotation peut importe le type de rotor multipliée par l’accélération gravitationnelle terrestre.
Comment convertir des RPM en RCF?
Avec un tableau d’estimation qui permet de croiser le rayon avec la vitesse en RPM pour connaître la RCF
Qu’est-ce que la poussée d’Archimède?
C’est la force verticale qui s’oppose à la sédimentation d’une particule par la résistance du milieu et de la masse et densité de la particule
Qu’est-ce qui fait varier la vitesse de sédimentation?
Plus la particule est dense plus grande sera la vitesse, mais plus le milieu est dense plus la vitesse sera petite.
Quel facteur influe sur l’hydrodynamisme d’une particule? Donne un exemple.
La forme de la particule.
Une particule fibreuse causera une plus grande force de friction parce qu’elle est très longue, tandis qu’une protéine globulaire offrira moins de résistance et donc plus d’hydrodynamisme par sa circularité.
Quelles sont les particularités des centrifugeuses qui tendent à varier?
- Différents rotors, volumes, vitesses
- Contrôle de la vitesse d’accélération ou décélération
- Contrôle de la Tº de centrifugation
Quels sont les deux principaux type de rotor?
- Rotor à angle fixe
- Rotor à godets oscillants
Quel est l’avantage et le désavantage d’utiliser un rotor à angle fixe?
La centrifugation sera plus rapide
Adapté à supporter de plus grandes vitesses
Ne peut pas accueillir des gros volumes
Quel est l’avantage et désavantage d’utiliser des rotors à godets oscillants?
Permet de traiter des gros volumes
Ne peut supporter des forces élevées de centrifugation
Quelles sont les précautions à prendre lorsqu’on utilise une centrifugeuse?
- Balancer le rotor
- Pour +100 000 g on doit peser au centième près
- Pour + 300 000 g on doit peser au millième près
- Il ne doit plus y avoir de particules dans les solutions
Quels sont les deux grands types de centrifugation et les deux sous catégories pour la deuxième classe?
- Centrifugation différentielle
- Centrifugation sur gradient de densité
A) isopycnique (densité)
B) Zonale sur gradient (taille/masse)
En quoi consiste une centrifugation différentielle?
Série de centrifugations qui utilise des forces croissantes pour récupérer des culots et obtenir des préparation graduellement plus pures.
Sur que principe la centrifugation différentielle s’appuie t-elle?
Permet de séparer grossièrement les constituants cellulaires selon leur vitesse de sédimentation qui est régie par leur masse.
Part avec de grosses macromolécules pour se rendre aux plus petites.
Pourquoi la centrifugation différentielle donne des résultats de pureté et de rendement assez variables?
Parce qu’il est possible de perdre certains molécules puisque c’est une technique qui est plutôt grossière.
Comment remédier à la variabilité des résultats que procure la centrifugation différentielle?
En combinant cette technique avec d’autres types de centrifugation (sur gradient de densité) par la suite, l’utiliser seulement en étape 1.
Comment valider qu’on a purifié les bonnes structures ?
On va valider avec des biomarqueurs spécifiques à la structure .
Décrire la technique de centrifugation sur gradient de densité.
Dépose un échantillon d’intérêt sur un gradient de densité d’une solution de notre choix et on centrifuge cette préparation.
Comment peut-être le gradient?
Soit discontinu en ayant une superposition de concentrations ou continu (qui a été centrifugé au préalable)
En quoi consiste la centrifugation isopycnique?
On vient séparer notre échantillon selon la densité des particules.
On vient centrifuger à l’équilibre ce qui fait que les particules vont se stabiliser à l’endroit où la densité du gradient est égale à leur propre densité.
À quel détail faut-il prêter attention lorsqu’on fait une centrifugation isopycnique?
Il faut que la densité des particules d’intérêt soient entre les limites du gradient
Quel est l’impact de la masse dans une centrifugation isopycnique?
Va impacter seulement la vitesse de sédimentation vers la position d’équilibre.
Quel est la différence entre un gradient généré d’avance ou auto-généré?
Généré d’avance : on dépose l’échantillon sur le gradient.
Autogénéré : on mélange l’échantillon avec la solution gradient
Quel peut être le désavantage de la centrifugation isopycnique?
Le temps de centrifugation peut être long (heures et même jours)
Que faut-il vérifier quand on choisit un milieu de gradient de densité pour notre structure d’intérêt?
- Pas d’interaction avec structure (inerte)
- Pas de toxicité
- Pas interaction moléculaire forte qui empêche la sédimentation
- Molécules peu visqueuses
En quoi consiste la centrifugation zonale sur gradient de densité?
Dans ce cas, la densité des particules à purifier doivent être plus grande que la densité la plus élevée du gradient et on ne vient par centrifuger à l’équilibre pour séparer les plus lourdes par la vitesse et non la densité.
Quel type de rotor est efficace pour quel type de technique?
Angle fixe :
Excellent pour culotter, mais pas vraiment pour zonale ou isopycnique
Godet oscillants : Pas bon pour culotter, mais bon pour zonale et isopycnique
Quel est le principe de la précipitation?
Réduire la solubilité des molécules (ADN, protéines) par formation d’agrégats en solution.
Quels modulations peuvent permettre une précipitation?
- Changement pH
- Ajout sels
- Ajout solvants
- Changement de température
Comment accélérer la sédimentation par précipitation?
Centrifugation
Comment faire une précipitation de protéines avec un sel?
Faut faire un salting out pour que les ions compétitionnent pour les molécules d’eau pour les sortir de solution, ne sera plus hydraté en surface.
Quel est l’avantage de faire un salting out au sulfate d’ammonium?
C’est facile d’utilisation et pas cher, non dénaturant pour préserver la conformation de la protéine
Qu’est-ce qu’un salting-in?
Augmente la solubilité d’une protéine par ajout faibles concentrations de sels.
Les ions salins se lient à la surface des protéines, vu qu’ils sont de même charge, la répulsion entre les protéines va être accentuée ce qui réduit leur agrégation
