Cours 2 - Techniques de séparation des molécules I : Extraction et filtration Flashcards
Que nécessitent la majorité des projets de rechercher en biologie
Nécessitent l’extraction, l’enrichissement ou la purification de composantes
Que permet la succession d’extraction, enrichissement ou purification ?
L’analyse appropriée du composé purifier pour faire de la bonne science
Quels sont les paramètres à considérer pour faire une bonne purification?
Quelles étapes à effectuer selon la classe ou la nature des contaminants et comment préserver l’intégrité de nos composantes
- Taille
- Solubilité
- Charge
- Densité
- Marqueur ajouté ou «tag»
Quelle est la première étape s’il on veut extraire des composantes des cellules?
Lyser les cellules pour quelles puissent libérer leur contenu dans un tampon de lyse
Quels sont les grands types traitements pour faire une extraction?
Combinaison de
- mécaniques
- chimiques
- enzymatiques
Quelles sont les méthodes d’extraction principales pour les cellules (bactéries, cellules en cultures)? (2)
- Pour les cellules en suspension : centrifugation à basse vitesse pour former un culot de cellules
- Pour les cellules adhérentes : trypsinisation (protéine qui délie avec le plastique) suivie d’une centrifugation
Quelles sont les méthodes d’extraction principales pour les tissus?
- 1re traitement grossier sans tampon
- Traitement avec un tampon de lyse sur les morceaux
Quelle est la technique de choix pour procéder à l’extraction de tissus congelés broyé mécaniquement, souvent dans l’azote liquide
Mortier et pilon
Quels sont les avantages de mortier et pilon?
- Efficace tissus rigides
- Préservation biomolécules à basse Tº
- Peu coûteux
Quels sont les désavantages du mortier et pilon?
- Méthode lente et manuelle
- Nécessite de l’azote liquide
- Pas très adapté aux grands volumes
Pour quels types cellulaires ciblés peut ont utiliser la technique du blender mécanique et comment?
- Tissus volumineux : cartilage, foie, os
Homogénéisation par lames rotatives à haute vitesse
Quels sont les avantages d’adopter la technique du blender?
- Convient pour des grands volumes
- Rapide pour homogénéiser les tissus durs
- Peu coûteux
Quels sont les désavantages d’adopter la technique du blender?
- Génère beaucoup de chaleur
- Moins précis pour libérer les contenus cellulaires
- Non adapté aux petits volumes
Que permet l’appareil rotor-stator et pour quels tissus est-il adaptés?
Fragmentation mécanique des tissus mous par forces de cisaillement générées par un Homogénéisateur de rotor rapide à l’intérieur d’un type rotor-stator
stator perforé.
Tissus mous : foie, cerveau, tissus conjonctifs.
Quels sont les avantages de l’utilisation du rotor-stator?
- Rapide et efficace pour homogénéiser des tissus mous
- Adapté aux grands volumes
- Possibilité de préserver les organites cellulaires
Quels sont les désavantages de l’utilisation du rotor-stator?
- Moins efficace pour les tissus rigides
- Génère de la chaleur nécessitant un refroidissement
Que permet l’appareil homogénéisateurs de type Dounce et Potter-Elvehjem et pour quels tissus est-il adaptés?
Homogénéisation douce par frottement dans un tube en verre avec un piston ajusté.
Cellules en culture, tissus mous : foie, cerveau
Quels sont les avantages d’utiliser un homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem?
- Préserve les organites cellulaires (noyaux, mitochondries)
- Méthode douce pour lyse partielle.
Quels sont les désavantages d’utiliser un homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem?
- Moins efficace pour les cellules robustes (bactéries, levures)
- Inefficace pour les tissus rigides
Que permet l’appareil homogénéisateurs à billes et pour quels tissus est-il adaptés?
- Agitation rapide de billes pour billes détruire les parois cellulaires.
- Cellules robustes : levures, bactéries Gram+.
Quels sont les avantages d’utiliser un homogénéisateur à billes?
- Très efficace pour les parois épaisses
- Homogène pour petits volumes
Quels sont les désavantages d’utiliser un homogénéisateur à billes?
- Génère de la chaleur
- Inefficace pour de grands morceaux de tissus
Que permet l’appareil homogénéisateurs à haute pression et pour quels tissus est-il adaptés?
Passage forcé des cellules dans une ouverture sous haute pression
Bactéries, levures en suspension
Quels sont les avantages d’utiliser un homogénéisateur haute pression?
- Très efficace pour lyser les bactéries et levures robustes
Quels sont les désavantages d’utiliser un homogénéisateur haute pression?
- Inefficace pour tissus rigides (cartilage, os)
- Limité aux suspensions liquides
- Volumes traités souvent restreints
Que permet l’appareil ultrasonique (sonication) et pour quels tissus est-il adaptés?
- Vibrations ultrasonores créant des forces de cavitation.
- Cellules individuelles en suspension : bactéries, levures
Quels sont les avantages d’utiliser la sonication?
- Efficace pour les bactéries et cellules individuelles
- Facile à utiliser pour les suspensions
Quels sont les désavantages d’utiliser la sonication?
- Génère de la chaleur (utiliser de la glace)
- Peut fragmenter l’ADN ou dénaturer les protéines sensibles
Quels sont les 5 types de traitements
Détergents non-ioniques
Agents osmotiques
Enzymes pour dégrader la paroi
Détergents ioniques
Agents chaotropiques
Quel est le rôle principal des agents chaotropiques?
Déstabiliser les interactions hydrophobes et hydrogènes, dénaturer les protéines et acides nucléiques, et dissocier les membranes
Quelles interactions les agents chaotropiques déstabilisent-ils?
Les interactions hydrophobes et hydrogènes
Quels types de molécules sont extraits à l’aide d’agents chaotropiques?
Protéines insolubles, l’ADN et l’ARN
Les agents chaotropiques sont-ils dénaturants?
Oui
Donne trois exemple d’agents chaotropiques
- Urée (6-8 M)
- GuHCl (guanidine chlorhydrate)
- Phénol-chloroforme
Donne un exemple de détergent ionique
SDS
Quelle est la conséquence de l’utilisation de détergents ioniques sur les protéinesT
Destruction des membranes lipidiques et dénaturent les protéines
Pour quelle application utilise-t-on le SDS
Pour la lyse complète et l’extraction protéique
Quels sont les 3 enzymes vues pour dégrafer la paroi cellulaire?
- Lysozyme
- Zymolase
- Cellulase
Quelle enzyme est utilisée pour dégrader la paroi des bactéries Gram +?
Lysozyme
Quelle est l’application principale des enzymes dégradant la paroi cellulaire?
Lyse des bactéries Gram +, levures, cellules végétales
Quels composés sont utilisés comme agents osmotiques?
- Eau distillée
- NaCl (1-2 M)
- Saccharose (1-2 M)
Comment les agents osmotiques affectent-ils les cellules?
Provoquent une entrée ou une sortie d’eau dans les cellules, entraînant éclatement ou fragilisation
Donnez une application des agents osmotiques dans la biologie cellulaire
Lyse des cellules animales ou sensibles, pré-traitement
Les agents osmotiques peuvent ils parfois être dénaturants?
Oui, mais seulement dans certains cas
Donnez deux exemples de détergents non ioniques
Triton X-100, Tween-20
Quelle est l’application principale des détergents non ioniques?
Extraction de protéines solubles
Pourquoi les détergents non ioniques ne dénaturent-ils pas les protéines?
Ils perturbent doucement les membranes lipidiques sans affecter les structures des protéines
Quelles techniques faut-il utiliser pour préserver la conformations, activités, structure des molécules.
- Lyse en milieu physiologique avec un système tampon
- Lyse douce
- Travail sur glace pour ralentir l’activité des enzymes
- Utilisation de réactifs RNase-free, DNase-free
- Utilisation d’inhibiteurs de protéases
- Ajout d’agent réducteurs pour empêcher l’oxydation de l’air
Quelles sont les deux types de purification suite à l’extraction?
- Dialyse
- Filtration
Comment fonctionne la dialyse?
Par principe physico-chimique
- 2 compartiments séparés par une membrane semi-perméable (plusieurs porosités dispo)
- Les solutés diffusent grâce au gradient de concentration suite à l’atteinte de l’équilibre
Quel est le désavantage de la dialyse ?
Méthode lente (24h) qui doit être répétée plusieurs fois
Si la molécule est trop petite, elle va diffuser dans le bécher
Pour quelles utilisations procède t-on à la dialyse?
- Dessalage
- Retrait de contaminants (urée, agents chaotropiques)
- Concentration de protéines (solution hypertonique)
- Pour les grands volumes
Quels sont les deux types de filtration?
Filtration avec filtres de porosité de grande taille
Ultrafiltration avec filtres de porosité de petites tailles
Comment procède on pour faire de la filtration?
- Basse pression avec seringue ou pompe
À quoi sert la filtration?
Retirer les débris cellulaires (clarification), bactéries résiduels solides
Suite à l’extraction et avant la purification via centrifugation
À quoi sert l’ultrafiltration?
Pour concentrer les macromolécules (protéines, ADN), éliminer les petites molécules (sels, agents chaotropes) ou changement de tampon
Comment procéder à l’ultrafiltration?
Utiliser la haute pression par centrifugation
Quel est l’avantage de l’ultrafiltration?
Méthode simple et rapide
Plus adaptée aux petits volumes
