Cours 7

Question 1

Quelles sont les utilités du séquençage (5)?

Answer 1

1. structure des génoms et phylogénie
2. détermination de la structure d’un gène et sa fonction
3. déterminer les polymorphismes (SNP)
4. prédire les produits possibles de fragments ADN
5. Analyser les variation génétiques

Question 2

Quelles sont les deux méthodes de séquençages des années 70s?

Answer 2

1. Chimique (maxam-gilbert)

2. Enzymatique (sanger)

Question 3

Quel est le principe général de la méthode chimique (3 étapes)

Answer 3

• Digestion enzymatique
• Déphosphorylation 5’ (phosphatase)
• Kinaser à l’extremité 5’ avec un g-32ATP

Question 4

Méthode chimique

Après un marquage, que fait-on et pourquoi?

Answer 4

Recouper avec une 2e enzyme de restriction pour n’avoir qu’un brin marqué au g-32ATP

Question 5

Quelles sont les étapes de la méthode chimique?

à revoir

Answer 5

• Marquage au g-32ATP
• Digestion
• Purifier sur un gel
• Hydrolyse chimique spécifiques des 4 nucléos
• Gel dénaturant + polyarylamide

Question 6

Comment et par quoi les purines sont modifiées?

Answer 6

Méthylation par DMS

Question 7

Par quoi sont modifiée les pyrimidines?

Answer 7

Hydrazine

Question 8

Que fait la pipéridine

Answer 8

• Clive les brins apyrimidiques et apuriniques

- Génère des fragments de taille correspondant à la taille des nuclos modifiés

Question 9

Comment faire des modifications chimiques de A et G?

Answer 9

pH, sels

Question 10

Que reste t il à faire après les modifications chimiques des bases?

Answer 10

Électrophorèse et autoradiographie

Question 11

La méthode chimique:
A) peut se faire directement sur un plasmide?
B) production d’adn double brin nécessaire?
C) nécessaire de le faire migrer sur plusieurs gels?
D) permet de visualiser des nucléotides très près du site de marquage?
E) Un gel à 20% et un à 12.5%?

Answer 11

A) peut se faire directement sur un plasmide? Oui
B) production d’adn double brin nécessaire? Non, simple brin
C) nécessaire de le faire migrer sur plusieurs gels? Oui
D) permet de visualiser des nucléotides très près du site de marquage? Oui
E) Un gel à 20% et un à 12.5%? Non un à 20 et un à 8%

Question 12

Quels sont les désavantages (3) de la méthode chimique?

Answer 12

• très capricieux
• extrême sensibilité à la fraîcheure
• pureté des réactifs

Question 13

Sur quoi repose la méthode enzymatique?
A) une phosphorylation de la base 5’
B) une interruption de l’adn pol en phase d’initiation
C) une interruption de l’adn pol en phase d’élongation

Answer 13

C) une interruption de l’adn pol en phase d’élongation

Question 14

Méthode enzymatique:

Que faut il, avec l’adn pol?

Answer 14

di-déoxynucléotide (2’3’-didéoxynucléo tri phosphate)

Question 15

Méthode enzymatique:

Que faut il dans une “chain terminator”

Answer 15

• ddNTPs

- Pas de OH sur le 3’C du déoxyribose

Question 16

Méthode enzymatique:

Quelles molécules a t on utilisé pour marquer l’adn et pourquoi a t on changé?

Answer 16

• a-P32-ATP
• a P33 ATP: plus longue 1/2 vie
• a 35S ATP: meilleure résolution , signal moins puissant

Question 17

Quel était le problème de la méthode enzymatique
A) la résolution des gels
B) l’extension d’amorce
C) le marqueur d’adn

Answer 17

A) la résol!

Question 18

A) À quoi sont couplés les ddNTPs

B) À quoi servent ils?

Answer 18

A) Des fluorochromes de couleurs différentes

B) Électrophorèse capillaire en continu, réaction dans un seul tube

Question 19

À quoi sert une extension d’amorce (2)?

Answer 19

localiser le site d’initiation de la transcription d’un gène
et
permet de délimiter la région promoteur (caractériser les régions régulatrices)

Question 20

Que permet la caractérisation d’un promoteur (3) ?

Answer 20

• expression d’un gène régulé selon le tissus, l’âge
• connaître les composantes: pathologies dues à l’expression ectopique d’un gène
• focer l’expression d’un tissus spécifique d’un transgène

Question 21

Comment peut aussi se faire la régulation de l’expression génique?

Answer 21

au niveau de la région 5’ non codante d’un mRNA

Question 22

Comment localiser le site d’initiation de la transcription d’un gène?

Answer 22

• réaction d’extension d’amorce marquée radioactivement (complmentaire au gène et région d’homologie près de ATG)
• réaction d’élongation avec un RT

Question 23

Comment la RT va agir?

Answer 23

Elle va allonger / copier en adn, l’arnm du gène jusqu’à ce qu’elle atteigne l’etrémité 5’ du messager et la fin de l’élongation correspond au site d’initiation de la transcription

Question 24

Comment séquencer un arnm par primer extension?

Answer 24

• Preparer un hybridation de l’amorce marquée radioactivement
• Séparer en 4 tubes
• Faire une extension à la RT en modifiant dNTP/ddNTP
  (RT moins sensible à la présence de ddNTP pour inhiber l’extension ou bloquer l’élongation)