Cours 3 Flashcards
Quelles sont les 3 catégories des TAAN
- Amplification du signal
- Amplification de la sonde
- Amplification de la cible
Quel est le but de la PCR
Générer de grande quantité d’adn à partir d’une seule copie.
Vrai ou faux. l’amorce anti-sens va de 3’ vers 5’
Faux, elle va de 5’ vers 3’
Quelles sont les étapes de la PCR? (environ 4)
- ADN initial
- Dénaturation (95C)
- Hybridation
- Synthèse
Comment choisir des amorces?
- Encadrent la région à amplifier
2. Capable de s’hydrider sur le brin d’adn grâce à la complémentarité
Taille idéale des amorces?
18-30 nucléo
Que veut on éviter des amorces?
Des structures secondaires tel que des hairpin, dimer, self dimer.
Quelle est la température de fusion idéale?
Quelle est la “formule”?
entre 55-65 degrés 4C x (G+C) + 2C (A+T)
Batérie thermus aquaticus: A) Gram? B) Se développe à quelle température C) Laquelle de ses enzymes a été utilisée D) La demi-vie de cette enzyme
A) Gram -
B) 50-80C (idéal: 70C)
C) ADN pol: Taq
D) 40 min à 95C
Quelles autres bactéries thermophiles ont été utilisées pour leur pol? Pourquoi E.coli n’est pas dans cette liste?
pyrococcus furiosus (Pfu) thermococcus litoralis (Vent ou Tli) thermus thermophilus (Tth) E.coli s'hybride à 37C donc elle s'hybride un peu partout... c'est pas génial
Vrai ou faux. La taille du fragment amplifié dépend de l’étape de transcription.
Faux. Dépend de la phase d’élongation
Quels sont les éléments nécessaire pour faire une pcr
appareil, amorce, tampon, adn matrice, nucléo (…?)
Quels sont les inconvénients de la détection sur gel d’agarose (3)?
- Faible précision: différentiation basée sur la taille
- Faible sensibilité: La coloration au bromure d’ethidium n’est pas quantitative
- Pas d’automatisation: migration du gel nécessaire
Vrai ou Faux. Une PCR en temps réel utilise à la fois un marqueur fluorescent (SYBR green) sans l’utilisation d’une sonde à hydrolyse
Faux: avec l’utilisation d’une sonde à hydrolyse
Le pcr en temps réel repose sur: A) FISH B) FRET C) activité exonucléase de l'adn pol 5' D) activité exonucléase de l'adn pol 3'
B) FRET
C) exonucléase 5’
Fret, énergie circule dans quel sens?
rapporteur (haute énergie) vers le quencher (basse énergie)
Quand est ce qu’on peut voir la fluo (FRET)?
Lorsque la sonde est dégradée par la pol 5’ exo. Pour chaque molecule d’adn synthétisée, une sonde dégradée -> un rapporteur fluo
Relier le test à sa description
A) PCR nichée
B) multiplex
C) rt-pcr
1) amplification de plusieurs cibles en même temps
2) 2 séries d’amorces dans le même gène
3) amplification à partir d’arn
A-2
B-1
C-3
PCR: pourquoi pourrait il y avoir des résultats faussement négatifs? (3)
- Déterioration d’un réactif
- Dysfonctionnement du thermocycleur
- Présence d’un composé inhibiteur dans un échantillon test.
Quoi faire pour éviter les faux négatifs?
Ajouter un contrôle positif à chaque test et un contrôle interne d’amplification
Qu’est ce qu’un contrôle interne?
Un fragment d’adn non cible, ex: adn de plante pour un échantillon humain
Sans contrôle interne, qu’est ce qu’un résultat négatif signifie? (4)
- Mauvais fonctionnement de l’appareil
- Une erreur dans la préparation du mélange réactionnel
- Une diminution de l’activité de l’adn pol
- La présence d’un substance inhibitrice dans l’adn extrait
Quels sont les 3 types de contamination d’un échantillon négatif?
- Échantillon pré PCR (lors du prélèvement, etc.)
- Des réactifs (amplifications précédantes)
- Lors d la détection (voir résultats des échantillons précédents
Comment éviter les faux positifs (3)?
- Ajouter un contrôle négatif
- Aliquoter en petites quantité les réactifs
- Utilisation de pièces séparées
Dans quelle pièce est le thermocycleur?
3e pièce
Quel est la particularité des polymérases de LAMP?
Forte activité de déplacement de brins
Exemple de pol utilisée avec LAMP?
Bst de Bacillus stearothermophilus
LAMP
A) combien d’amorce?
B) Quelle température?
A) 4 amorces
B) 60-65 C
Comment peut se faire la détection (LAMP)
Turbidité dans un tube
Méthode d’amplification basée sur la transcritpion (2)?
NASBA: nucleic acid based amplification (biomerieux)
TMA: transcription mediated amplification (genprob)
