Cours 5 Flashcards
Quelles sont ls 5 étapes du clonages moléculaires (tsé la diapo répétée 200 fois)
1) Digestion du fragment d’intérêt par des enzymes de restriction
2) Digestion du vecteur de clonage (enzyme de restriction)
3) Ligation de l’insert et du vecteur pour la construction du plasmide recombinant
4) Transformation dans des cllules bactérienne compétentes
5) Isolation du plasmide recombinant et confirmation de la construction moléculaire par digestion/PCR et séquençage
Quelles sont les utilités du clonage moléculaire
1) expression d’une protéine hétérologue ou non, pour purifiation et production industrielle, cristallographie, production d’Ac
2) expression de gènes pour des études de génétique et physiologie cellulaire
3) fusion de promoteurs pour des études de profil transcriptionnel
4) criblages génétiques et génétique bactérienne
5) séquençage
Quel est le codon de départ? et le codon de fin?
Départ: ATG, AUG
Fin: TAA, UAA
Ou débute la traduction chez les batéries?
RBS
Quelles sont les sources de l’insert pour le clonage?
1) Produit PCR spécifique
2) Plasmide recombinant - sous-clonage
Qu’est ce que le sous-clonage (plasmide recombinant)?
digestion de l’insert contenu dans une construction existante et sous-clonage dans un autre vecteur (sites compatibles)
Quelles enzymes de restriction sont utilisées?
A) Exonucléases
B) Endonucléases
C) Site de restrcition en 5’
Endonucléases
Combien de nucléotides devraient être ajoutés à quelle extrémité?
6 nucléotides en 5’
Quels sont l’ordre des séquences d’une amorce de type forward?
1) nucléotides en extra 5’
2) Site de restriction
3) rbs
4) codon de départ
5) section homologue avec le gène
6) gène d’intérêt
Qu’y a t il de différent dans les séquences entre l’amorce de type forward et reverse?
fusion traductionnelle, exemple étiquette histidine
Qu’est ce qu’une mutation non conservative, et conservative?
Non-conservative: inactiver l’activité d’un enzyme (mutant catalytique)
Conservative: éliminer un site de restriction
Comment faire pour muter au milieu du gène?
Cloner la version sauvage et amplifier tout le plasmide avec une paire d’amorce qui introduit la mutation.
Vrai ou Faux. Les plasmides multicopie possèdent un mécanisme de régulation autonome
Faux. le mécanisme est basé sur l’inhibition plamsidique par la cellule.
comment les plasmides assurent leur conservation dans les cellules hôtes
propagation d’anti-toxine par la cellule mère, si les cellules filles n’ont pas le plasmide (protecteur) elles meurent. Ex: ColE1 et la colicine
Si la séquence RBS doit être ajoutée, quelles sont ls options?
1) Inclure la séq RBS naturelle
2) Ajouter une séquence RBS sur l’amorce en forward, en aval du site de restriction et en amont de la séquence d’homologie du gène
Vrai ou Faux. La séquence RBS est conservée à travers les espèces bactériennes
Faux, elle varie entre les espèces bactériennes
Pourquoi les vecteurs sont utiles?
- Maintien stable des inserts
2) régulation de l’expression des gènes clonés par l’usage de promoteurs contrôlables
3) fusion transcriptionnelle ou traductionnelle
Comment s’assurer de la qualité de l’adn?
- spectrophotométrie
- gel d’agarose
Comment ls enzymes font elles pour ne pas s’autodigérer
Méthylases (système de restriction/modification)
Enzymes de resctriction de type 1: spécificité?
Coupent l’adn après leur séquence de recon., distance entre les séq de recon et les séq clivée variable
Type suicide
peu commune en bio mol
Enzymes de resctriction de type 1, quelles sont les 3 sous unités?
1) lie la séq de recon
2) de modification qui méthyle l’adn reconnu
3) digère l’adn en aval de l’adn méthylé
Enzyme de restriction de type 2: caractéristiques?
- coupe l’adn dans leurs séquence de recon
- constituées d’une seule unité pour la recon et le clivage
- effectue plusieurs rondes sans être inactivées
- util en bio mol
EcoRI, quelle est la nomnclature?
E: genre bactérien, majuscule, italique
co: 2 prem lettre du nom de l’espèce
R: nom de la souche, lettre majuscule
I: chiffre romain, # d’enzyme
Quel est le ratio ug/hure pour la digestion de l’enzyme de restriction?
1 ug d’adn / heure, habituellement utilisée en excès (5-10X)
Bouts francs ou cohésifs: A) EcoRI B) EcoRV C) MlsI D) Sall E) Bgll
A) Cohésif B) Franc C) Franc D) cohésifs E) cohésifs
Qu’est ce que l’activité étoile?
Condition non favorables pour l’enzyme de restriction (chaleur, tampon…) et perdent leur spécificité. Coupent l’adn dans d’autres séquence qu la leur. HF ont moins d’activité étoile.
Quelle est la différence entre clonage directionnel et non directionnel?
Non directionnel a 2 orientation possible du aux sites avec les mêmes nucléo
De quoi faut il s’assurer pour faire une digestion double?
D’avoir les conditions idéales pour les deux enzymes
Si l’enzyme a un site de restriction dans le gène… que fait on?
Digestion partielle, on dilue l’enzyme, migration sur gel et on prend le plus long fragment.
