Cours 5

Question 1

Quelles sont ls 5 étapes du clonages moléculaires (tsé la diapo répétée 200 fois)

Answer 1

1) Digestion du fragment d’intérêt par des enzymes de restriction
2) Digestion du vecteur de clonage (enzyme de restriction)
3) Ligation de l’insert et du vecteur pour la construction du plasmide recombinant
4) Transformation dans des cllules bactérienne compétentes
5) Isolation du plasmide recombinant et confirmation de la construction moléculaire par digestion/PCR et séquençage

Question 2

Quelles sont les utilités du clonage moléculaire

Answer 2

1) expression d’une protéine hétérologue ou non, pour purifiation et production industrielle, cristallographie, production d’Ac
2) expression de gènes pour des études de génétique et physiologie cellulaire
3) fusion de promoteurs pour des études de profil transcriptionnel
4) criblages génétiques et génétique bactérienne
5) séquençage

Question 3

Quel est le codon de départ? et le codon de fin?

Answer 3

Départ: ATG, AUG

Fin: TAA, UAA

Question 4

Ou débute la traduction chez les batéries?

Answer 4

RBS

Question 5

Quelles sont les sources de l’insert pour le clonage?

Answer 5

1) Produit PCR spécifique

2) Plasmide recombinant - sous-clonage

Question 6

Qu’est ce que le sous-clonage (plasmide recombinant)?

Answer 6

digestion de l’insert contenu dans une construction existante et sous-clonage dans un autre vecteur (sites compatibles)

Question 7

Quelles enzymes de restriction sont utilisées?
A) Exonucléases
B) Endonucléases
C) Site de restrcition en 5’

Answer 7

Endonucléases

Question 8

Combien de nucléotides devraient être ajoutés à quelle extrémité?

Answer 8

6 nucléotides en 5’

Question 9

Quels sont l’ordre des séquences d’une amorce de type forward?

Answer 9

1) nucléotides en extra 5’
2) Site de restriction
3) rbs
4) codon de départ
5) section homologue avec le gène
6) gène d’intérêt

Question 10

Qu’y a t il de différent dans les séquences entre l’amorce de type forward et reverse?

Answer 10

fusion traductionnelle, exemple étiquette histidine

Question 11

Qu’est ce qu’une mutation non conservative, et conservative?

Answer 11

Non-conservative: inactiver l’activité d’un enzyme (mutant catalytique)
Conservative: éliminer un site de restriction

Question 12

Comment faire pour muter au milieu du gène?

Answer 12

Cloner la version sauvage et amplifier tout le plasmide avec une paire d’amorce qui introduit la mutation.

Question 13

Vrai ou Faux. Les plasmides multicopie possèdent un mécanisme de régulation autonome

Answer 13

Faux. le mécanisme est basé sur l’inhibition plamsidique par la cellule.

Question 14

comment les plasmides assurent leur conservation dans les cellules hôtes

Answer 14

propagation d’anti-toxine par la cellule mère, si les cellules filles n’ont pas le plasmide (protecteur) elles meurent. Ex: ColE1 et la colicine

Question 15

Si la séquence RBS doit être ajoutée, quelles sont ls options?

Answer 15

1) Inclure la séq RBS naturelle
2) Ajouter une séquence RBS sur l’amorce en forward, en aval du site de restriction et en amont de la séquence d’homologie du gène

Question 16

Vrai ou Faux. La séquence RBS est conservée à travers les espèces bactériennes

Answer 16

Faux, elle varie entre les espèces bactériennes

Question 17

Pourquoi les vecteurs sont utiles?

Answer 17

1. Maintien stable des inserts
   2) régulation de l’expression des gènes clonés par l’usage de promoteurs contrôlables
   3) fusion transcriptionnelle ou traductionnelle

Question 18

Comment s’assurer de la qualité de l’adn?

Answer 18

• spectrophotométrie

- gel d’agarose

Question 19

Comment ls enzymes font elles pour ne pas s’autodigérer

Answer 19

Méthylases (système de restriction/modification)

Question 20

Enzymes de resctriction de type 1: spécificité?

Answer 20

Coupent l’adn après leur séquence de recon., distance entre les séq de recon et les séq clivée variable
Type suicide
peu commune en bio mol

Question 21

Enzymes de resctriction de type 1, quelles sont les 3 sous unités?

Answer 21

1) lie la séq de recon
2) de modification qui méthyle l’adn reconnu
3) digère l’adn en aval de l’adn méthylé

Question 22

Enzyme de restriction de type 2: caractéristiques?

Answer 22

• coupe l’adn dans leurs séquence de recon
• constituées d’une seule unité pour la recon et le clivage
• effectue plusieurs rondes sans être inactivées
• util en bio mol

Question 23

EcoRI, quelle est la nomnclature?

Answer 23

E: genre bactérien, majuscule, italique
co: 2 prem lettre du nom de l’espèce
R: nom de la souche, lettre majuscule
I: chiffre romain, # d’enzyme

Question 24

Quel est le ratio ug/hure pour la digestion de l’enzyme de restriction?

Answer 24

1 ug d’adn / heure, habituellement utilisée en excès (5-10X)

Question 25

Bouts francs ou cohésifs: 
A) EcoRI
B) EcoRV
C) MlsI
D) Sall
E) Bgll

Answer 25

A) Cohésif
B) Franc
C) Franc
D) cohésifs
E) cohésifs

Question 26

Qu’est ce que l’activité étoile?

Answer 26

Condition non favorables pour l’enzyme de restriction (chaleur, tampon…) et perdent leur spécificité. Coupent l’adn dans d’autres séquence qu la leur. HF ont moins d’activité étoile.

Question 27

Quelle est la différence entre clonage directionnel et non directionnel?

Answer 27

Non directionnel a 2 orientation possible du aux sites avec les mêmes nucléo

Question 28

De quoi faut il s’assurer pour faire une digestion double?

Answer 28

D’avoir les conditions idéales pour les deux enzymes

Question 29

Si l’enzyme a un site de restriction dans le gène… que fait on?

Answer 29

Digestion partielle, on dilue l’enzyme, migration sur gel et on prend le plus long fragment.