Cours 4 Flashcards
Qu’appelle-t-on l’inactivation insertionnelle?
dans le plasmide pBR322, il y a 2 gènes de résistances. L’un d’eux va s’inactiver lors de l’insertion du fragment par ligation.
Qu’est-ce que le plamide pUC18?
- un dérivé de bactériophage M13
- est + utilisé car un seul gène de résistance
A quoi sert le gène lacZ dans le plasmide pUC18?
marqueur de sélection négative
Qu’est-ce que la béta-galactosidase?
protéine codée par le gène lacZ sous forme d’homotétramère
Quelles réactions catalysent la béta-gal?
- hydrolyse du lactose en glucose et galactose
- transglycosylation du lactose en allolactose (
Qu’es-ce que l’allolactose?
- inducteur de la transcription
- se lie au répresseur de Lac
Comment faire un clonage dans pBR322?
- digestion PstI
- plasmide ouvert
- insertion ADN
- reconstitué le plasmide (avec ou sans insert)
- des bactéries incorporent le plasmides avec insert, d’autres non et plasmides vides
- milieu sélectif (ampicilline) => intégration du gène d’intéret
Qu’est-ce que l’opéron lactose?
en présence de lactose, le répresseur est inhibée, les 3 gènes de lacZ peuvent être transcrit et traduit en B-gal
Comment réprimer lacZ?
- allolactose
- isopropyl (IPTG)
Qu’est-ce que l’alpha complémentation?
- plasmide avec lacZ
- souche E.Coli avec une délétion de lacZ
=> il faut les 2 souches pour reconstituer l’homotétramère actif
Comment mettre en évidence l’alpha complémentation?
Test bleu/blanc :
milieu avec Amp+ IPTG + X-gal => colonies blanches correspondent au vecteur recombinant
Qu’es-ce que le clonage TA?
- tire profit de l’activité transférase terminale de l’ADNpol (Taq)
- ajoute un A en 3’
- PCR
Qu’es-ce que le clonage TOPO TA?
combine les avantages du clonage TA + activité de ligation des toposimérases => ligation en + rapide
Qu’es-ce que le clonage sans ligation (LIC)?
hybridation de l’ext cohésive sb d’au moins 12 bases sur le vecteur et l’insert par PCR
Qu’est-ce que le clonage par recombinaison?
clonage GATEWAY = recombinaison site-spécifique par le phage lambda qui intègre son ADN dans E.Coli
Comment faire un clonage par recombinaison?
- processus d’intégration (lysogénie) catalysé par 2 enzymes intégrase (phage) + OHF (E.Coli)
- recombinaison de sites de l’ADN du phage
- processus réversible
A quoi servent les étiquettes et où se placent-elles?
- utilisées dans l’expression des prot recombinantes
- améliore la solubilité
- purifier la prot par affinité
- ajout en N-ter ou C-ter
Nommer les différentes étiquettes les plus utilisées?
- étiquette polyhistidine
- étiquette Glutathione S-transférase (GST)
Qu’est-ce que l’étiquette polyhistidine?
- 6 résidus His
- coordination avec des ions métalliques Ni2+ ou Co2+
A quoi est sensible l’étiquette de polyhistidine?
EDTA
Comment éliminer l’étiquette de polyhistidine?
- par compétition avec de l’imidazole
- ou pH acide
Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette polyhistidine?
faible risque d’interférence avec la structure de la prot et son activité
Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette GST?
bonne affinité + solubilité
Comment éliminer une étiquette GST?
par compétition avec du glutathion réduit
Citer des modèles utilisés pour l’expression et la production de protéines?
- E.Coli
- Sasscharomyces Cerevisiae
- cellules d’insectes infectés par un virus
- cellules de mammifères
Comment choisir les modèles d’expression de protéines?
- en f° du type de prot
- en f° de la solubilité
- en f° de son activité
- en f° des codons
Quels sont les avantages d’utiliser E.Coli comme modèle d’expression des protéines?
- rapide (1 semaine)
- simple
- temps de génération court
- les protéines représentent 30% de la biomasse
- les protéines chaperonnes en baissant la température
- la formation de ponts disulfures
- PAS de modifications post-trad
Citer 2 méthodes qui permettent d’augmenter l’efficacité d’une transformation et rendent les cellules compétentes ?
- electroporation
- transformation par choc thermique
En quoi consiste la transformation par E.Coli ?
faire rentrer un plasmide dans E.Coli, pour cela on rend les cellules compétentes
Définir l’efficacité de transformation?
le nombre de colonies ou unité formant la colonie (UFC) qui seraient générées par la transformation d’1 µg de plasmide dans un volume donné, de la cellule compétente
Quelles sont les étapes de l’électroporation?
- centrifugation sur glace
- mélange de TOUTES les cellules + plasmide (en DEHORS de la glace)
- electrochoc
- milieu avec ampicilline
Quelles sont les étapes du choc thermique?
- centrifugation sur glace
- mélange QQS cellules + plasmide (DANS la glace)
- choc thermique (augmentation de la température)
- milieu sur ampicilline
Quelles sont les différences entre le choc thermique et l’électroporation?
- électroporation : toutes les cellules sont utilisées, et elles sont mélangées à T° ambiante avec le plasmide
- choc thermique : une fraction de cellules est utilisée, elles sont mélangées avec le plasmide dans un bain de glace
Citer la constitution d’un vecteur (plasmide)?
- ori
- marqueur de sélection
- promoteur
- cassette de clonage
Citer les paramètres de culture de E.Coli
- concentration en IPTG
- température d’induction
- durée d’incubation
- milieu
- agitation et oxydation
Décrire la courbe de croissance d’une bactérie?
- phase de latence
- phase exponentielle de croissance
- phase stationnaire
- phase de décroissance
A partir de quelle DO la phase exponentielle de croissance d’une bactérie est atteinte?
0.5
A partir de quelle DO la phase stationnaire d’une bactérie est atteinte?
1.0
Quels sont les avantages d’utiliser Saccharomyces Cerevisiae?
- cellules eucaryotes
- meilleure repliement des protéines
- nombreuses modifications post-trad
- manipulation aisée du génome
- temps de génération court
Citer des plasmides de levure
- YIp: Yeast Integrating plasmid
- YRp: Yeast Replicating plasmid
- YCp: Yeast Centromere plasmid
- YEp: Yeast Episomal plasmid
Quelle est l’autre levure utilisée à part S. Cerevisiae?
Pichia pastoris
Quel est l’avantage d’utiliser P. Pastoris au lieu de S. Cerevisiae?
- permet un plus fort taux d’expression
- très haute densité optique
Donner le nom du virus à l’origine de l’expression des cellules d’insectes?
Baculovirus
Quels sont les avantages de produire des transformations à partir de cellules d’insectes infectées?
- production efficace de ponts disulfures
- production de N-glycanes
- faible production de O-glycanes
Comment préparer des virus recombinants?
- insertion dans la cellule
- intégration du gène dans le BAC (bacterial artificial chromosome)
- transfection dans des cellules d’insectes qui produit un stock de virus
- détermination sur plaque
Pourquoi l’utilisation des cellules d’insectes transformées est moins utilisée que les bactéries ou les levures?
- stock
- hotte et outillages adéquates
- milieu de culture cher
Quels sont les 2 types de cellules de mammifères utilisées pour les transformations?
- HEK 293 (cellules embryonnaires humain)
- CHO (ovule d’hamster)
Quel est l’inconvénient de l’utilisation d’E.Coli dans l’expression de protéines in vitro?
très faible production de protéines
Quels sont les avantages d’utiliser E.Coli dans l’expression de protéines in vitro?
- PCR linéaire
- production de protéines toxiques
- marquage isotopique
- incorporation d’aa non naturel
- production rapide
En quoi consiste la lyse cellulaire?
- casse rapide et efficace des cellules en minimisant la protéolyse et l’oxydation
- préparation d’extraits cellulaires
Citer les techniques de lyse
- chimique
- enzymatique
- mécanique
En quoi consiste la lyse enzymatique?
- lyser des petits volumes
- à base de détergents
En quoi consiste la lyse chimique ?
- détergents non ioniques : attaque la membrane
- les bactéries sont plus faciles à lyser que les levures (membrane plus épaisse)
Quelles sont les 2 enzymes utilisées pour la lyse cellulaire?
- le lysozyme : pour dégrader les peptidoglycanes
- ADNase I: pour couper l’ADN
- Benzonase : pour couper l’ADN ou l’ARN
Citer les 3 types de lyse mécanique?
- sonification
- pression
- billes de verre
En quoi consiste la lyse mécanique par sonification?
vibrations ultrasoniques à haute fréquence qui génèrent des ondes de choc assez fortes pour casser les parois et fractionner les acides nucléiques
En quoi consiste la lyse mécanique par pression?
- suspension cellulaire sous pression à travers une valve de faible diamètre
- cassure par dépression et cisaillement
En quoi consiste la lyse mécanique par billes de verre?
Broyage avec des billes de verre. Les cellules passent à travers un mixeur et sont désintégrées
Citer les étapes de l’extraction d’ADN plasmidique?
- culture bactérienne transformées
- centrifugation pour éliminer le milieu
- resuspension
- lyse par du SDS ou NaOH
- neutralisation avec adétate de potassium et acide acétique: étape de sélection de l’ADN plasmidique
- nettoyage + concentration par colonne
- fixation à l’éthanol
- lavage
- élution à pH basique : l’ADN est stable et va se réhydrater
