Cours 4 Flashcards
Qu’appelle-t-on l’inactivation insertionnelle?
dans le plasmide pBR322, il y a 2 gènes de résistances. L’un d’eux va s’inactiver lors de l’insertion du fragment par ligation.
Qu’est-ce que le plamide pUC18?
- un dérivé de bactériophage M13
- est + utilisé car un seul gène de résistance
A quoi sert le gène lacZ dans le plasmide pUC18?
marqueur de sélection négative
Qu’est-ce que la béta-galactosidase?
protéine codée par le gène lacZ sous forme d’homotétramère
Quelles réactions catalysent la béta-gal?
- hydrolyse du lactose en glucose et galactose
- transglycosylation du lactose en allolactose (
Qu’es-ce que l’allolactose?
- inducteur de la transcription
- se lie au répresseur de Lac
Comment faire un clonage dans pBR322?
- digestion PstI
- plasmide ouvert
- insertion ADN
- reconstitué le plasmide (avec ou sans insert)
- des bactéries incorporent le plasmides avec insert, d’autres non et plasmides vides
- milieu sélectif (ampicilline) => intégration du gène d’intéret
Qu’est-ce que l’opéron lactose?
en présence de lactose, le répresseur est inhibée, les 3 gènes de lacZ peuvent être transcrit et traduit en B-gal
Comment réprimer lacZ?
- allolactose
- isopropyl (IPTG)
Qu’est-ce que l’alpha complémentation?
- plasmide avec lacZ
- souche E.Coli avec une délétion de lacZ
=> il faut les 2 souches pour reconstituer l’homotétramère actif
Comment mettre en évidence l’alpha complémentation?
Test bleu/blanc :
milieu avec Amp+ IPTG + X-gal => colonies blanches correspondent au vecteur recombinant
Qu’es-ce que le clonage TA?
- tire profit de l’activité transférase terminale de l’ADNpol (Taq)
- ajoute un A en 3’
- PCR
Qu’es-ce que le clonage TOPO TA?
combine les avantages du clonage TA + activité de ligation des toposimérases => ligation en + rapide
Qu’es-ce que le clonage sans ligation (LIC)?
hybridation de l’ext cohésive sb d’au moins 12 bases sur le vecteur et l’insert par PCR
Qu’est-ce que le clonage par recombinaison?
clonage GATEWAY = recombinaison site-spécifique par le phage lambda qui intègre son ADN dans E.Coli
Comment faire un clonage par recombinaison?
- processus d’intégration (lysogénie) catalysé par 2 enzymes intégrase (phage) + OHF (E.Coli)
- recombinaison de sites de l’ADN du phage
- processus réversible
A quoi servent les étiquettes et où se placent-elles?
- utilisées dans l’expression des prot recombinantes
- améliore la solubilité
- purifier la prot par affinité
- ajout en N-ter ou C-ter
Nommer les différentes étiquettes les plus utilisées?
- étiquette polyhistidine
- étiquette Glutathione S-transférase (GST)
Qu’est-ce que l’étiquette polyhistidine?
- 6 résidus His
- coordination avec des ions métalliques Ni2+ ou Co2+
A quoi est sensible l’étiquette de polyhistidine?
EDTA
Comment éliminer l’étiquette de polyhistidine?
- par compétition avec de l’imidazole
- ou pH acide
Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette polyhistidine?
faible risque d’interférence avec la structure de la prot et son activité
Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette GST?
bonne affinité + solubilité