Cours 4 Flashcards

1
Q

Qu’appelle-t-on l’inactivation insertionnelle?

A

dans le plasmide pBR322, il y a 2 gènes de résistances. L’un d’eux va s’inactiver lors de l’insertion du fragment par ligation.

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Q

Qu’est-ce que le plamide pUC18?

A
  • un dérivé de bactériophage M13

- est + utilisé car un seul gène de résistance

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3
Q

A quoi sert le gène lacZ dans le plasmide pUC18?

A

marqueur de sélection négative

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4
Q

Qu’est-ce que la béta-galactosidase?

A

protéine codée par le gène lacZ sous forme d’homotétramère

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5
Q

Quelles réactions catalysent la béta-gal?

A
  • hydrolyse du lactose en glucose et galactose

- transglycosylation du lactose en allolactose (

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6
Q

Qu’es-ce que l’allolactose?

A
  • inducteur de la transcription

- se lie au répresseur de Lac

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7
Q

Comment faire un clonage dans pBR322?

A
  • digestion PstI
  • plasmide ouvert
  • insertion ADN
  • reconstitué le plasmide (avec ou sans insert)
  • des bactéries incorporent le plasmides avec insert, d’autres non et plasmides vides
  • milieu sélectif (ampicilline) => intégration du gène d’intéret
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8
Q

Qu’est-ce que l’opéron lactose?

A

en présence de lactose, le répresseur est inhibée, les 3 gènes de lacZ peuvent être transcrit et traduit en B-gal

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9
Q

Comment réprimer lacZ?

A
  • allolactose

- isopropyl (IPTG)

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10
Q

Qu’est-ce que l’alpha complémentation?

A
  • plasmide avec lacZ
  • souche E.Coli avec une délétion de lacZ
    => il faut les 2 souches pour reconstituer l’homotétramère actif
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11
Q

Comment mettre en évidence l’alpha complémentation?

A

Test bleu/blanc :

milieu avec Amp+ IPTG + X-gal => colonies blanches correspondent au vecteur recombinant

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12
Q

Qu’es-ce que le clonage TA?

A
  • tire profit de l’activité transférase terminale de l’ADNpol (Taq)
  • ajoute un A en 3’
  • PCR
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13
Q

Qu’es-ce que le clonage TOPO TA?

A

combine les avantages du clonage TA + activité de ligation des toposimérases => ligation en + rapide

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14
Q

Qu’es-ce que le clonage sans ligation (LIC)?

A

hybridation de l’ext cohésive sb d’au moins 12 bases sur le vecteur et l’insert par PCR

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15
Q

Qu’est-ce que le clonage par recombinaison?

A

clonage GATEWAY = recombinaison site-spécifique par le phage lambda qui intègre son ADN dans E.Coli

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16
Q

Comment faire un clonage par recombinaison?

A
  • processus d’intégration (lysogénie) catalysé par 2 enzymes intégrase (phage) + OHF (E.Coli)
  • recombinaison de sites de l’ADN du phage
  • processus réversible
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17
Q

A quoi servent les étiquettes et où se placent-elles?

A
  • utilisées dans l’expression des prot recombinantes
  • améliore la solubilité
  • purifier la prot par affinité
  • ajout en N-ter ou C-ter
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18
Q

Nommer les différentes étiquettes les plus utilisées?

A
  • étiquette polyhistidine

- étiquette Glutathione S-transférase (GST)

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19
Q

Qu’est-ce que l’étiquette polyhistidine?

A
  • 6 résidus His

- coordination avec des ions métalliques Ni2+ ou Co2+

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20
Q

A quoi est sensible l’étiquette de polyhistidine?

A

EDTA

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21
Q

Comment éliminer l’étiquette de polyhistidine?

A
  • par compétition avec de l’imidazole

- ou pH acide

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22
Q

Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette polyhistidine?

A

faible risque d’interférence avec la structure de la prot et son activité

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23
Q

Quel est l’avantage d’utiliser une étiquette GST?

A

bonne affinité + solubilité

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24
Q

Comment éliminer une étiquette GST?

A

par compétition avec du glutathion réduit

25
Q

Citer des modèles utilisés pour l’expression et la production de protéines?

A
  • E.Coli
  • Sasscharomyces Cerevisiae
  • cellules d’insectes infectés par un virus
  • cellules de mammifères
26
Q

Comment choisir les modèles d’expression de protéines?

A
  • en f° du type de prot
  • en f° de la solubilité
  • en f° de son activité
  • en f° des codons
27
Q

Quels sont les avantages d’utiliser E.Coli comme modèle d’expression des protéines?

A
  • rapide (1 semaine)
  • simple
  • temps de génération court
  • les protéines représentent 30% de la biomasse
  • les protéines chaperonnes en baissant la température
  • la formation de ponts disulfures
  • PAS de modifications post-trad
28
Q

Citer 2 méthodes qui permettent d’augmenter l’efficacité d’une transformation et rendent les cellules compétentes ?

A
  • electroporation

- transformation par choc thermique

29
Q

En quoi consiste la transformation par E.Coli ?

A

faire rentrer un plasmide dans E.Coli, pour cela on rend les cellules compétentes

30
Q

Définir l’efficacité de transformation?

A

le nombre de colonies ou unité formant la colonie (UFC) qui seraient générées par la transformation d’1 µg de plasmide dans un volume donné, de la cellule compétente

31
Q

Quelles sont les étapes de l’électroporation?

A
  • centrifugation sur glace
  • mélange de TOUTES les cellules + plasmide (en DEHORS de la glace)
  • electrochoc
  • milieu avec ampicilline
32
Q

Quelles sont les étapes du choc thermique?

A
  • centrifugation sur glace
  • mélange QQS cellules + plasmide (DANS la glace)
  • choc thermique (augmentation de la température)
  • milieu sur ampicilline
33
Q

Quelles sont les différences entre le choc thermique et l’électroporation?

A
  • électroporation : toutes les cellules sont utilisées, et elles sont mélangées à T° ambiante avec le plasmide
  • choc thermique : une fraction de cellules est utilisée, elles sont mélangées avec le plasmide dans un bain de glace
34
Q

Citer la constitution d’un vecteur (plasmide)?

A
  • ori
  • marqueur de sélection
  • promoteur
  • cassette de clonage
35
Q

Citer les paramètres de culture de E.Coli

A
  • concentration en IPTG
  • température d’induction
  • durée d’incubation
  • milieu
  • agitation et oxydation
36
Q

Décrire la courbe de croissance d’une bactérie?

A
  • phase de latence
  • phase exponentielle de croissance
  • phase stationnaire
  • phase de décroissance
37
Q

A partir de quelle DO la phase exponentielle de croissance d’une bactérie est atteinte?

A

0.5

38
Q

A partir de quelle DO la phase stationnaire d’une bactérie est atteinte?

A

1.0

39
Q

Quels sont les avantages d’utiliser Saccharomyces Cerevisiae?

A
  • cellules eucaryotes
  • meilleure repliement des protéines
  • nombreuses modifications post-trad
  • manipulation aisée du génome
  • temps de génération court
40
Q

Citer des plasmides de levure

A
  • YIp: Yeast Integrating plasmid
  • YRp: Yeast Replicating plasmid
  • YCp: Yeast Centromere plasmid
  • YEp: Yeast Episomal plasmid
41
Q

Quelle est l’autre levure utilisée à part S. Cerevisiae?

A

Pichia pastoris

42
Q

Quel est l’avantage d’utiliser P. Pastoris au lieu de S. Cerevisiae?

A
  • permet un plus fort taux d’expression

- très haute densité optique

43
Q

Donner le nom du virus à l’origine de l’expression des cellules d’insectes?

A

Baculovirus

44
Q

Quels sont les avantages de produire des transformations à partir de cellules d’insectes infectées?

A
  • production efficace de ponts disulfures
  • production de N-glycanes
  • faible production de O-glycanes
45
Q

Comment préparer des virus recombinants?

A
  • insertion dans la cellule
  • intégration du gène dans le BAC (bacterial artificial chromosome)
  • transfection dans des cellules d’insectes qui produit un stock de virus
  • détermination sur plaque
46
Q

Pourquoi l’utilisation des cellules d’insectes transformées est moins utilisée que les bactéries ou les levures?

A
  • stock
  • hotte et outillages adéquates
  • milieu de culture cher
47
Q

Quels sont les 2 types de cellules de mammifères utilisées pour les transformations?

A
  • HEK 293 (cellules embryonnaires humain)

- CHO (ovule d’hamster)

48
Q

Quel est l’inconvénient de l’utilisation d’E.Coli dans l’expression de protéines in vitro?

A

très faible production de protéines

49
Q

Quels sont les avantages d’utiliser E.Coli dans l’expression de protéines in vitro?

A
  • PCR linéaire
  • production de protéines toxiques
  • marquage isotopique
  • incorporation d’aa non naturel
  • production rapide
50
Q

En quoi consiste la lyse cellulaire?

A
  • casse rapide et efficace des cellules en minimisant la protéolyse et l’oxydation
  • préparation d’extraits cellulaires
51
Q

Citer les techniques de lyse

A
  • chimique
  • enzymatique
  • mécanique
52
Q

En quoi consiste la lyse enzymatique?

A
  • lyser des petits volumes

- à base de détergents

53
Q

En quoi consiste la lyse chimique ?

A
  • détergents non ioniques : attaque la membrane

- les bactéries sont plus faciles à lyser que les levures (membrane plus épaisse)

54
Q

Quelles sont les 2 enzymes utilisées pour la lyse cellulaire?

A
  • le lysozyme : pour dégrader les peptidoglycanes
  • ADNase I: pour couper l’ADN
  • Benzonase : pour couper l’ADN ou l’ARN
55
Q

Citer les 3 types de lyse mécanique?

A
  • sonification
  • pression
  • billes de verre
56
Q

En quoi consiste la lyse mécanique par sonification?

A

vibrations ultrasoniques à haute fréquence qui génèrent des ondes de choc assez fortes pour casser les parois et fractionner les acides nucléiques

57
Q

En quoi consiste la lyse mécanique par pression?

A
  • suspension cellulaire sous pression à travers une valve de faible diamètre
  • cassure par dépression et cisaillement
58
Q

En quoi consiste la lyse mécanique par billes de verre?

A

Broyage avec des billes de verre. Les cellules passent à travers un mixeur et sont désintégrées

59
Q

Citer les étapes de l’extraction d’ADN plasmidique?

A
  • culture bactérienne transformées
  • centrifugation pour éliminer le milieu
  • resuspension
  • lyse par du SDS ou NaOH
  • neutralisation avec adétate de potassium et acide acétique: étape de sélection de l’ADN plasmidique
  • nettoyage + concentration par colonne
  • fixation à l’éthanol
  • lavage
  • élution à pH basique : l’ADN est stable et va se réhydrater