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L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules > Cours 2 > Flashcards

Cours 2 Flashcards

1
Q

Quelles sont les techniques permettant de concentrer les protéines?

A
  • chromatographie
  • electrophorèse
  • dialyse
  • ultrafiltration
  • lyophilisation
  • précipitation
  • cristallisation
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Q

Citer les 3 chromatographies

A
  • filtration sur gel (SEC)
  • échangeuse d’ions (IEX)
  • en phase réverse (RP)
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Q

En quoi consiste la chromatographie de filtration sur gel?

A
  • exclusion des macromolécules par un gel de polyacrylamide

- colonne Zeba à centrifuger

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4
Q

En quoi consiste la chromatographie échangeuse d’ions (IEX)?

A

résine échangeuse d’ions mixte, permet de capturer les anions et cations non organiques

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Q

Quel problème rencontre-t-on lorsqu’on fait une chromatographie échangeuse d’ions?

A

risque d’acidification et précipitation des protéines

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6
Q

En quoi consiste la chromatographie en phase réverse (RP)?

A
  • permet la séparation, dessalage et concentration des protéines
  • utilisation d’un solvant volatile
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7
Q

A quoi sert la chromatographie en phase réverse ?

A

préparer les échantillons de spectroscopie de masse

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8
Q

Quel est le risque de la chromatographie en phase réverse?

A

protéines souvent dénaturées

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9
Q

Qu’est-ce qu’une dialyse?

A
  • méthode de séparation en fonction de la taille

- transfert de masses diffusifs par différence de concentration à travers une membrane semi-perméable

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10
Q

A quoi sert une dialyse?

A
  • enlever les solutés de faible poids d’une solution protéique
  • echanger la solution protéique avec le moins de perturbations possibles
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11
Q

En quoi consiste une dialyse?

A

2 compartiments séparés par une membranes semi-perméable. Les macromolécules ne peuvent pas passer, seules les molécules solubles le peuvent.

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12
Q

Citer les facteurs affectant la dialyse

A
  • volume de l’échantillon
  • taille des pores (MWCO)
  • type de membrane
  • température
  • viscosité
  • taille de la molécule
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13
Q

Quelles sont les conditions de la dialyse?

A
  • petit volume d’échantillon pour un grand volume de solution
  • basse température (4°) pour préserver la protéine
  • renouvellement de l’échantillon
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14
Q

Qu’est-ce que l’ultrafiltration (UF)?

A
  • ne laisse pas passer les ions et les petits molécules via une membrane semi-perméable
  • transfert de masse par différence de pression
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15
Q

Comment doivent-être les membranes d’ultrafiltration?

A

résistante à la pression et perméable

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16
Q

Qu’est-ce que la diafiltration?

A

échange de tampon par ultrafiltration

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17
Q

Citer les 2 méthodes de diafiltration

A
  • continue (V constant)

- discontinue (centrifugation puis ajout de solutions)

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18
Q

Qu’est-ce que la lyophilisation?

A

concentration des protéines par évaporation ou en faisant bouillir

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19
Q

Comment faire pour arriver au point d’ébullition sans dénaturer la protéine? et dans quelle méthode utilise-t-on l’ébullition?

A
  • lyophilisation

- concentration sous vide, il faut diminuer la pression

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20
Q

Donner les étapes de la lyophilisation

A
  • congélation : stabilisation des protéines (attention aux cristaux de glace)
  • déssication primaire (80% du solvant est sublimé)
  • déssication secondaire (enleve le solvant)
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21
Q

En quoi consiste la précipitation?

A
  • séparer une protéine d’une solution en la faisant passer à l’état solide par modification de sa solubilité
  • le précipité est séparer par centrifugation
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22
Q

Comment induire la précipitation?

A

addition de sels, solvants organiques, ions métallique, acides/bases, polymères hydrophobes

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23
Q

Pourquoi la technique de précipitation pour concentrer les protéines n’est pas beaucoup utilisée?

A

altère souvent les protéines

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24
Q

Quels sont les précipités les plus courant?

A
  • éthanol
  • acétone
  • chloroforme
  • méthanol
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25
Q

Quelle méthode utilise-t-on pour ne pas altérer les protéines lors d’une précipitation

A

précipitation non dénaturante par du PEG (polymère hydrophile) et des sels neutres

26
Q

En quoi consiste la cristallisation?

A
  • concentre, purifie et stabilise la protéine

- molécules hautement ordonnées dans des cristaux

27
Q

Pourquoi n’utilise-t-on pas souvent la cristallisation?

A

cristallisation est plus difficile à obtenir que la précipitation

28
Q

Donner les étapes de cristallisation

A

dite “goutte en suspension”.
Une goutte de protéine est placée au dessus du réservoir. Le réservoir étant plus concentrer, il y aura une diffusion de la goutte vers le réservoir

29
Q

Comment quantifier les protéines?

A
  • Loi de Beer-Lambert
  • spectro absorption UV
  • specrto absorption visible
30
Q

A quelle longueur d’onde absorbee les ADN?

A

260nm

31
Q

A quoi doit-on faire attention lorsqu’on purifie les AN?

A

l’échantillon doit être pur.

EDTA et phénol absorbent au aussi à 260nm

32
Q

A quoi sert de mesurer la quantité de protéines?

A

de calculer les rendements et activité spécifique

33
Q

Quelle loi utilise-t-on si on a un mélange protéique?

A

Warbung et Christian

34
Q

Que donne le rapport des DO?

A

l’indice de pureté

35
Q

Pourquoi faisons-nous une spectro à 205nm pour les protéines, alors qu’elles absorbent à 280nm?

A

pour éviter les interférences des solvants et les composants biologiques

36
Q

Définir le coefficient d’extinction

A

somme de toutes les espèces qui absorbent des photons dans une molécule

37
Q

Citer les 3 méthodes de colorimétries

A
  • test de Bradford
  • test de Lowry
  • test BCA
38
Q

En quoi consiste le test de bradford?

A
  • bleu de coomassie
  • pH acide
  • résidus aromatiques
39
Q

Donner les avantages et inconvénients du test de bradford

A
  • facile
  • sensible
  • bon marché
  • mauvais pour les petites protéine
  • gamme linéaire
  • perturbé par les détergents
40
Q

En quoi consiste le test de Lowry?

A

2étapes :

  • réduction de Biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines
  • amplification du signal par la réduction de Folin-Ciocalteu
  • coloration bleu (7550nm)
41
Q

Donner les avantages et les inconvénients du test de Lowry

A
  • sensible aux détergents
  • plage dynamique
  • rapide
  • stable
42
Q

En quoi consiste le test de BCA?

A

dérivé du test de Lowry:

  • réaction de biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines
  • amplification du signal par la réduction par l’acide bicinchoninique (BCA)
  • couleur pourpre
43
Q

Donner les avantages et les inconvénients du test de BCA

A
  • améliore la sensibilisation du test
  • tolérance aux agents interférants
  • sensible aux agents chélatants du cuivre
  • sensible à la température
44
Q

Donner les étapes de l’électrophorèse

A
  • séparation d’ADN ou ARN en fonction de la taille
  • matrice de séparation inerte ou gel
  • champ électrique (+ la molécule est grande, moins elle migre)
  • colorants pour réveler
  • échelle pour analyser la tailles
45
Q

Définir l’électrophorèse

A

décrit la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique

46
Q

Citer 2 gels utilisés pour séparer les AN en électrophorèse

A
  • gel d’agarose
  • gel polyacrylamide (PAGE)
    car les ADN ont des charges négatives
47
Q

Citer 2 tampons d’électrophorèse

A
  • TAE : bonne résolution, mais capacité vite épuisée

- TBE : bonne résolution, grande capacité

48
Q

Comment révéler les AN lors d’une électrophorèse?

A
  • bromure d’éthidium: intercalant

- ADN révélé dans les UV

49
Q

Citer les autres méthodes de coloration des gels d’électrophorèse

A
  • SYBR gold
  • bleu de méthylène
  • cuivre
  • coloration à l’argent
50
Q

Quelle molécule est principalement séparée en électrophorèse PAGE?

A

ARN

51
Q

Donner les avantages du PAGE par rapport aux autres électrophorèses

A
  • meilleure résolution

- visualisation des conditions natives (AN/protéines)

52
Q

Donner les avantages et les inconvénients de l’électrophorèse PAGE dite “en conditions natives”

A
  • peut pas distinguer la taille, la forme et la mobilité
  • peut pas estimer la pureté ou le PM
  • on peut séparer et catégoriser les échantillons
53
Q

Définir le SDS-PAGE et que met-il en évidence?

A
  • Dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE)
  • permet d’identifier et suivre les protéines lors des étapes de purification
  • détermine la composition et le PM
54
Q

Donner les étapes du SDS-PAGE

A
  • protéines traitées au SDS chaud : casse les liaisons non covalentes + linéarise les les molécules
  • agent réducteur des ponts disulfures : sépare les SU
  • migration : donne la masse
55
Q

Définir le SDS-PAGE par Leammli (1970)

A

système discontinu de 2 gels:

  • gel de séparation
  • gel d’empilage
56
Q

A quoi sert la différence de tampons et de gels utilisés lors d’une électrophorèse SDS-PAGE de Laemmli ?

A
  • gels différents en porosité, pH, force ionique

- tampons permet de concentrer les échantillons dans le 1er gel et les séparer dans le 2e

57
Q

Donner les 4 composants du système discontinu du SDS-PAGE de Laemmli (du haut vers le bas)

A
  • tampon de migration
  • tampon de l’échantillon
  • gel de concentration
  • gel de séparation
58
Q

Donner les techniques de révélations non spécifiques et spécifiques des électrophorèses SDS-PAGE

A
  • non spécifiques : bleu de coomassie, à l’argent, au cuivre

- spécifiques : Western blot

59
Q

Donner les étapes générales de coloration des gels?

A
  • gel est fixé : immobilisation des protéines
  • gel est coloré
  • la coloration est stoppée ou décoloré pour réduire le bruit de fond
60
Q

Définir le bleu de Coomassie

A
  • triméthyléthane disulfonés (CBB R-250)

- interactions électrostatiques avec des aa basiques protonés (lys, arg, his) + résidus hydrophobes aromatique

L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules (8 decks)

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