Cours 2 Flashcards
Quelles sont les techniques permettant de concentrer les protéines?
- chromatographie
- electrophorèse
- dialyse
- ultrafiltration
- lyophilisation
- précipitation
- cristallisation
Citer les 3 chromatographies
- filtration sur gel (SEC)
- échangeuse d’ions (IEX)
- en phase réverse (RP)
En quoi consiste la chromatographie de filtration sur gel?
- exclusion des macromolécules par un gel de polyacrylamide
- colonne Zeba à centrifuger
En quoi consiste la chromatographie échangeuse d’ions (IEX)?
résine échangeuse d’ions mixte, permet de capturer les anions et cations non organiques
Quel problème rencontre-t-on lorsqu’on fait une chromatographie échangeuse d’ions?
risque d’acidification et précipitation des protéines
En quoi consiste la chromatographie en phase réverse (RP)?
- permet la séparation, dessalage et concentration des protéines
- utilisation d’un solvant volatile
A quoi sert la chromatographie en phase réverse ?
préparer les échantillons de spectroscopie de masse
Quel est le risque de la chromatographie en phase réverse?
protéines souvent dénaturées
Qu’est-ce qu’une dialyse?
- méthode de séparation en fonction de la taille
- transfert de masses diffusifs par différence de concentration à travers une membrane semi-perméable
A quoi sert une dialyse?
- enlever les solutés de faible poids d’une solution protéique
- echanger la solution protéique avec le moins de perturbations possibles
En quoi consiste une dialyse?
2 compartiments séparés par une membranes semi-perméable. Les macromolécules ne peuvent pas passer, seules les molécules solubles le peuvent.
Citer les facteurs affectant la dialyse
- volume de l’échantillon
- taille des pores (MWCO)
- type de membrane
- température
- viscosité
- taille de la molécule
Quelles sont les conditions de la dialyse?
- petit volume d’échantillon pour un grand volume de solution
- basse température (4°) pour préserver la protéine
- renouvellement de l’échantillon
Qu’est-ce que l’ultrafiltration (UF)?
- ne laisse pas passer les ions et les petits molécules via une membrane semi-perméable
- transfert de masse par différence de pression
Comment doivent-être les membranes d’ultrafiltration?
résistante à la pression et perméable
Qu’est-ce que la diafiltration?
échange de tampon par ultrafiltration
Citer les 2 méthodes de diafiltration
- continue (V constant)
- discontinue (centrifugation puis ajout de solutions)
Qu’est-ce que la lyophilisation?
concentration des protéines par évaporation ou en faisant bouillir
Comment faire pour arriver au point d’ébullition sans dénaturer la protéine? et dans quelle méthode utilise-t-on l’ébullition?
- lyophilisation
- concentration sous vide, il faut diminuer la pression
Donner les étapes de la lyophilisation
- congélation : stabilisation des protéines (attention aux cristaux de glace)
- déssication primaire (80% du solvant est sublimé)
- déssication secondaire (enleve le solvant)
En quoi consiste la précipitation?
- séparer une protéine d’une solution en la faisant passer à l’état solide par modification de sa solubilité
- le précipité est séparer par centrifugation
Comment induire la précipitation?
addition de sels, solvants organiques, ions métallique, acides/bases, polymères hydrophobes
Pourquoi la technique de précipitation pour concentrer les protéines n’est pas beaucoup utilisée?
altère souvent les protéines
Quels sont les précipités les plus courant?
- éthanol
- acétone
- chloroforme
- méthanol
Quelle méthode utilise-t-on pour ne pas altérer les protéines lors d’une précipitation
précipitation non dénaturante par du PEG (polymère hydrophile) et des sels neutres
En quoi consiste la cristallisation?
- concentre, purifie et stabilise la protéine
- molécules hautement ordonnées dans des cristaux
Pourquoi n’utilise-t-on pas souvent la cristallisation?
cristallisation est plus difficile à obtenir que la précipitation
Donner les étapes de cristallisation
dite “goutte en suspension”.
Une goutte de protéine est placée au dessus du réservoir. Le réservoir étant plus concentrer, il y aura une diffusion de la goutte vers le réservoir
Comment quantifier les protéines?
- Loi de Beer-Lambert
- spectro absorption UV
- specrto absorption visible
A quelle longueur d’onde absorbee les ADN?
260nm
A quoi doit-on faire attention lorsqu’on purifie les AN?
l’échantillon doit être pur.
EDTA et phénol absorbent au aussi à 260nm
A quoi sert de mesurer la quantité de protéines?
de calculer les rendements et activité spécifique
Quelle loi utilise-t-on si on a un mélange protéique?
Warbung et Christian
Que donne le rapport des DO?
l’indice de pureté
Pourquoi faisons-nous une spectro à 205nm pour les protéines, alors qu’elles absorbent à 280nm?
pour éviter les interférences des solvants et les composants biologiques
Définir le coefficient d’extinction
somme de toutes les espèces qui absorbent des photons dans une molécule
Citer les 3 méthodes de colorimétries
- test de Bradford
- test de Lowry
- test BCA
En quoi consiste le test de bradford?
- bleu de coomassie
- pH acide
- résidus aromatiques
Donner les avantages et inconvénients du test de bradford
- facile
- sensible
- bon marché
- mauvais pour les petites protéine
- gamme linéaire
- perturbé par les détergents
En quoi consiste le test de Lowry?
2étapes :
- réduction de Biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines
- amplification du signal par la réduction de Folin-Ciocalteu
- coloration bleu (7550nm)
Donner les avantages et les inconvénients du test de Lowry
- sensible aux détergents
- plage dynamique
- rapide
- stable
En quoi consiste le test de BCA?
dérivé du test de Lowry:
- réaction de biuret de réduction du cuivre en conditions alcalines
- amplification du signal par la réduction par l’acide bicinchoninique (BCA)
- couleur pourpre
Donner les avantages et les inconvénients du test de BCA
- améliore la sensibilisation du test
- tolérance aux agents interférants
- sensible aux agents chélatants du cuivre
- sensible à la température
Donner les étapes de l’électrophorèse
- séparation d’ADN ou ARN en fonction de la taille
- matrice de séparation inerte ou gel
- champ électrique (+ la molécule est grande, moins elle migre)
- colorants pour réveler
- échelle pour analyser la tailles
Définir l’électrophorèse
décrit la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique
Citer 2 gels utilisés pour séparer les AN en électrophorèse
- gel d’agarose
- gel polyacrylamide (PAGE)
car les ADN ont des charges négatives
Citer 2 tampons d’électrophorèse
- TAE : bonne résolution, mais capacité vite épuisée
- TBE : bonne résolution, grande capacité
Comment révéler les AN lors d’une électrophorèse?
- bromure d’éthidium: intercalant
- ADN révélé dans les UV
Citer les autres méthodes de coloration des gels d’électrophorèse
- SYBR gold
- bleu de méthylène
- cuivre
- coloration à l’argent
Quelle molécule est principalement séparée en électrophorèse PAGE?
ARN
Donner les avantages du PAGE par rapport aux autres électrophorèses
- meilleure résolution
- visualisation des conditions natives (AN/protéines)
Donner les avantages et les inconvénients de l’électrophorèse PAGE dite “en conditions natives”
- peut pas distinguer la taille, la forme et la mobilité
- peut pas estimer la pureté ou le PM
- on peut séparer et catégoriser les échantillons
Définir le SDS-PAGE et que met-il en évidence?
- Dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE)
- permet d’identifier et suivre les protéines lors des étapes de purification
- détermine la composition et le PM
Donner les étapes du SDS-PAGE
- protéines traitées au SDS chaud : casse les liaisons non covalentes + linéarise les les molécules
- agent réducteur des ponts disulfures : sépare les SU
- migration : donne la masse
Définir le SDS-PAGE par Leammli (1970)
système discontinu de 2 gels:
- gel de séparation
- gel d’empilage
A quoi sert la différence de tampons et de gels utilisés lors d’une électrophorèse SDS-PAGE de Laemmli ?
- gels différents en porosité, pH, force ionique
- tampons permet de concentrer les échantillons dans le 1er gel et les séparer dans le 2e
Donner les 4 composants du système discontinu du SDS-PAGE de Laemmli (du haut vers le bas)
- tampon de migration
- tampon de l’échantillon
- gel de concentration
- gel de séparation
Donner les techniques de révélations non spécifiques et spécifiques des électrophorèses SDS-PAGE
- non spécifiques : bleu de coomassie, à l’argent, au cuivre
- spécifiques : Western blot
Donner les étapes générales de coloration des gels?
- gel est fixé : immobilisation des protéines
- gel est coloré
- la coloration est stoppée ou décoloré pour réduire le bruit de fond
Définir le bleu de Coomassie
- triméthyléthane disulfonés (CBB R-250)
- interactions électrostatiques avec des aa basiques protonés (lys, arg, his) + résidus hydrophobes aromatique
