Chromato Flashcards
De quoi dépend la solubilité de protéines ?
De la concentration en sels dans la solution ainsi que de l’hydophobicité de la protéine.
A quoi peut servir une dialyse ? 3 trucs
Purifier une protéine par séparation de taille
Changer un tampon
Concentrer des macromolécules
Quels sont les deux principes utilisés lors des chromatographie ?
Adsorption
tamis
Sur un chromatogramme c’est quoi tr ? tm ?
Tr est le temps de rétention, qualitatif
Tm est le temps que met une protéine à passer la colonne sans être retenue
Qu’est-ce que le coefficient de distribution d’une chromato ?
C’est un coefficient K qui permet d’évaluer le rapport entre concentration dans la phase stationnaire et phase mobile.
Quelle est l’équation fondamentale de la chromatographie ?
Ve = Vm + Kd * Vs
Qu’est ce que le facteur de rétention alpha ?
Il s’agit d’un facteur qui évalue la position de deux pics adjacents sur le chromatogramme: Il est égal à tr2/tr1
Que permet d’évaluer la sélectivité lors d’une chromato ?
Permet d’évaluer la capacité d’un système à éluer deux solutions différentes à des temps Ve assez différentes
Que signifie un pic étroit ? Pour quelle grandeur ces pics étroits sont significatifs ?
un pic étroit signifie que la colonne est efficace : c’est donc une mesure de l’éfficacité
Qu’est ce qu’un plateau théorique ?
C’est le plus petit volume ou il y a un équilibre entre phase stationnaire et mobile, et donc ou K’ est réalisé.
dans un plateau théorique à quoi est égale le volume d’élution Ve ?
à N * Vh (volume de phase mobile du plateau)
Quelle relation lie nombre de plateau, temps de rétention et épaisseur des pics ?
Plus le nombre de plateaux théoriques est grand plus le pic est étroit.
Plus le temps de rétention est long plus le pic est large.
Comment peut on augmenter la résolution d’une chromatographie ?
On peut allonger la longueur de la colonne dans le but d’voir plus de plateaux théoriques
On peut aussi changer les conditions expérimentales
Si le pH > pI alors
chargé négativement
Comment éluer une colonne d’interaction hydrophobe ?
Avec un tampon de force ionique décroissante, ou avec des détergents
Définir hydrophobicité
Capacité qu’ont des molécules non polaires de s’associer entre elles pour limiter l’exposition de leurs régions hydrophobes à l’eau.
Quels sont les deux adsorbants disponibles pour des chromatographies d’affinité ?
à spectre large : spécifiques d’une classe de protéines
spécifiques : se fixent covalentement à la protéine à purifier
Quelles méthodes d’élution sont à disposition pour les chromatographies d’affinité ?
Changement de tampon
Changement de pH
Compétition avec une autre protéine
C’est quoi l’étiquette MBP ?
C’est une étiquette qui se couple très facilement à l’amylose et qui augmente la solubilité des protéines de fusion
Donner 4 avantages de l’étiquette GST
On peut l’utiliser dans tous les systèmes d’expression
Facilement détectée en Western
Site de coupure pour protéase dessus
Stabilise la protéine recombinante
Quelle forme est optimale pour la résolution dans une chromatographie par gel filtration ?
Longue et étroite
Définir le coefficient de partage Kd
(Ve-V0)/(Vt-V0-Vgel) avec V0 = Volume de solvant entre les billes
Définir le coefficient d’avancement Kav
Ve-V0/Vt-V0
Qu’est ce que la filtration sur gel permet de découvrir concernant la structure des protéines ?
elle permet de déterminer la structure oligomérique des protéines.D’abord on trouve la mass de la protéine totale puis dénaturation puis masse des SU
de quels tests simples et rapides dispose on pour vérifier la présence de la protéine à purifier ?
Test enzymatique si enzyme sinon SDS page ou Western
Dire ce que veut dire capture purification intermédiaire et polissage
Capture : isoler concentrer et stabiliser la protéine d’interêt
Purification intermédiaire : le gros de la prot est purifié
Polissage : on vire les contaminants résiduels (haute résolution et rendement)
Donner des ex de méthodes de capture
Affinité, EI, sels
Donner des ex de méthodes de Purif inter
Hydrophobe
Donner des ex de méthodes de polissage
Gel filtration, traitement aux sels
Sur quoi se base la purification avec les anticorps ?
Sur la très forte affinité de la prot A et G avec le domaine Fc des IGG
Comment marche purif anticorps ?
On couple A et G avec un anticorps spécifique à la protéine qu’on veut purif, puis inucub, centri, et élution avec tampon de charge SDS page
C’est quoi TAP tag ?
Une purif avec deux étiquettes qui permettent de virer bon nombre de faux positifs
Donner les trois étapes du TAP tag
Liaison de la protéine A aux IgG et élution
liaison CBP à la calmoduline avec C++
élution en présence d’EGTA
