Cours 3 Flashcards
Sur quel principe est basé la coloration à l’argent?
la réduction des ions d’argent
Quelles sont les étapes de la coloration à l’argent?
- le gel est fixé (immobilise les protéines + enlève les composés qui interfèrent)
- incubation du gel (fixation de l’Ag avec les protéines et réduction de la fixation du gel) = SENSIBILISATION
- imprégnation des ions Ag
- signal de coloration au cuivre par réduction des Ag
- le développement est arrêté par le bruit de fond
Sur quel principe est basé la coloration inverse au zinc ?
propriétés des protéines qui vont fixer et séquestrer les ions Zn2+ dans un milieu (précipitation imidazole + Zn = Znlm2)
Quels sont les avantages de la coloration inverse au zinc ?
cations métallique pour colorer rapidement les prot, sans fixation, ni colorant orga
Quels sont les avantages de la coloration aux sondes fluorescentes?
- très sensible
- offre un gamme de réponse linéaire (10 à 100 x plus importante que la colorimétrie)
Quels sont les inconvénients de la coloration aux sondes fluorescentes?
- disposer d’un appareillage adéquat
- source lumineuse monochromatique
- filtre (sépare les longueurs d’excitations + émission)
- syst de détection
Quelles sont les 2 types de sondes ?
1- sondes fluorogéniques : intésité du signal augmente par co-localisation avec les protéines
2- sondes intrinsèques fluorescentes : lient sélectivement les prot (et pas le gel)
Comment détecter les modif post-traductionnelles?
- détection par phosphorylation
- détection par les glycoprotéines
- détection des O-GlcNAc
Qu’est-ce que la détection des phosphorylations?
- permet de détecter les modif post-trad
- sonde dont une partie se lie au P couplé à un fluorochrome
Qu’est-ce que la détection de glycoprotéines?
- détecte les modif post-trad
- oxydation périodique du glycol + conjugaison hydrazide ( méca de base de Schiff)
Qu’est-ce que la détection des O-GlcNAc ?
- permet la détecttion des modif post-trad
- cyclo addition de Huisgen catalysée par le cuivre entre azide et alkyne
A quoi sert le WesternBlot?
suivre la purification de prot sans act enzymatique
Quand le WesterBlot est - il utilisé?
premières étapes de la purification
A quoi faut-il faire attention avant de faire une purification (WesternBlot)?
coloration des gels par le bleu de Coomassie
Quelles sont les étapes de la révélation du WesternBlot?
- bloquer la membrane avec des prot aspécifique
- AC primaire + AC sec
- lavage
A quoi doit-on faire attention pour l’AC secondaire ?
doit être couplé à une péroxydase : dégrade le substrat + génère la prod de photon + apparition locale de coloration
Dans quels cas l’électrophorèse 2D est utilisée ?
mélanges complexes (lysat cell ou fractions sub cell)
A quoi sert l’électrophorèse?
- séparer plusieurs centaines de prot
- séparer les isoformes d’une prot
Quelles sont les étapes de l’électrophorèse 2D?
1- séparation en f° charge
2- séparation en f° du PM
Qu’est-ce que la focalisation isoélectrique (IEF)?
méthode de séparation des molé amphotères en f° de leur charge
Comment préparer l’échantillon pour une IEF (focalisation isoélectrique)?
- haute [chaotrope] : urée
- détergent neutre
- réducteur de thiol
- ampholyte porteur
- absence d’autres ions
- forte résistance aux champs elec (I faible)
A quoi sert le chaotrope dans la préparation de l’échantillon de IEF (focalisation isoélectrique) ?
casser les liaisons H + interactions hydrophobes entre ET au sein des prot
A quoi sert le détergent dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?
casser les interactions hydrophobes
A quoi sert le réducteur de thiols dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?
casser les ponts disulfures
A quoi sert l’ampholyte porteur dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?
augmenter le pouvoir tampon + force ionique
De quoi est composé les tampons amphotères?
Ampholines : mélange d’acides oligo-amino + oligo-carboniques aliphatiques
Quel est le gradient de pH pour les tampons amphotères?
compris entre 3 et 10
Comment fonctionnent les tampons amphotères?
Les composés acides aliphatiques ont un fort pouvoir tampon + forment un gradient de pH (avec un champ électrique)
Comment est crée le gradient de pH immobilisé (IPG)?
groupements acides/basiques copolymérisés avec une matrice polyacrylamide
Comment crée un gradient de pH?
moins de 10 dérivés différents
Quelles sont les étapes de l’IEF (focalisation isoélectrique)?
1- réhydrater l'IPG (pH immobilisé) 2- positionner le Manifold 3- transférer le IPG vers le Manifold 4- humidifier + assembler les électrodes 5- mettre les échantillons 6- lecture dans l'Etan IPGphor3
A quoi sert la DIGE (Difference Gel Electrophoresis)?
- marquer des différents échantillons avec des sondes fluorescentes différentes
A quoi servent les sondes fluorescentes ?
détecter + quantifier les prot dans les gels
Pourquoi utiliser des sondes fluorescentes pour la DIGE?
- sont aussi sensibles que la coloration à l’Ag
- gamme de réponse linéaire
Quelles sont les étapes de la DIGE?
- marquage des échantillons avec différentes sondes fluorescentes
- mélanger les échantillons
- séparation sur gel 2D
- analyse d’image
Quelle partie utilise-t-on pour séquencer un peptide?
N-ter
Quels sont les 3 réactifs permettant d’identifier la partie N-ter d’un peptide (pour le séquencer)?
- FDNB (Sanger)
- Dansyl chloride
- Dabsyl chloride
Quel est le principe de la dégradation d’Edman
- Polypeptide + Phenylisothio cyanate
- Phe s’accroche en N-ter + clivage du peptide (chaine latérale)
- détection de Phe en N-ter
Quels sont les avantages de la dégradation d’Edman pour la séquençage du N-ter?
- séquençage automatique (sur le sequenator)
- tech sensible (qqs pg)
- bon rendement > 99%
- lecture max 50 aa
Quelles sont les étapes de séquençage des polypeptides?
- casser les pont disulfures
- coupure chimique ou enzymatique
- purification des peptides
- séquençage de chaque peptide
- mise en ordre
Quelles sont les différentes techniques de séquençage des polypeptides?
1- hydrolye et séparation
2- réaction avec le FDNB, hydrolye et séparation
3- casser les ponts disulfures (si présents), séparation, dégradation d’Edman
4- établir la séquence
A quoi sert la spectrométrie de masse?
déduire la masse précise d’une molé sous l’influence d’un champ élec ou magnétique (à vide)
Quelles sont les 2 méthodes de spectrométrie de masse?
- MALDI MS
- ESI MS
A quoi sert l’EMI MS?
- spectro de masse
- donne un nbr varaible de protons
- affiche des pics avec un incrément de charge de 1 et de masse 1 (1 proton)
Quelles sont les étapes de la MS en tandem (spectro de masse)?
- isolement d’un type de peptide par une MS
- sélection + fractionnement des peptides (1 coupure/pept)
- un des deux peptides possède une charge qui sera détectée
De quoi est composé le lot de pics des spectres MS/MS?
de tous les fragments chargés produits par la cassure du même type de liaison + même côté
Que représente chaque pic dans les spectres MS/MS?
1 aa de moins que le pic précédent
Comment identifier l’aa perdu entre chaque pic du spectre MS/MS?
différence de masse entre les peptides (prb : Leu et Ile)
Qu’est-ce qu’une enzyme?
- participe à une réaction chimique en augmentant
- augmente la vitesse
- n’apparait pas dans les produits
qu’est-ce que la constante de proportionnalité (k+2)?
étapes de ES à P
pseudo ordre 1
A quoi correspond le kcat?
nombre de turnover = nbr max de molé de S converties en P/site actif/tps
Qu’est-ce que l’état quasi-stationnaire? Que permet-elle de calculer?
- vitesse de réaction est cst
- [ES] ne varie pas
- constante Michealis-Menten (Km)
Comment mesurer l’AS d’une réaction enzymatique?
test basé sur la capacité à faire la distinction entre les prop. physicochimiques du S et du P (de manière quantifiable)
Quels tests effectuons nous pour mesurer l’activité d’une enzyme?
- test continu
- test continu couplé
- test discontinu
- test radiométrique
En quoi consiste un test continu?
- capacité à mesurer en continu la disparition d’un S ou l’apparition d’un P
- basé sur de la spectro (absorption UV ou émission de fluorescence)
En quoi consiste le test continu couplé?
Quand le S n’a pas de prop spectro, il faut ajouter des E en plus pour coupler = prop spectro
(ex: NADH)
En quoi consiste le test discontinu?
- le réaction E est stoppée manuellement
- séparation de S (95%)
- quantification par intervalle de temps (radiométrique)
En quoi consiste le test radiométrique?
- noyau instable de radio-isotope subit une décroissance pour former un isotope stable = béta-émission
- comptage à scintillation d’émission des béta particules = détermine la radioA (cpm)
Qu’est-ce que les endonucléases de restrictions?
- coupent l’ADN viral en laissant intégre l’ADN bactérien protégé par des méthylations
- découvertes par Werner Arber 1960
- sont synthétisées à partir de bactéries
- 3 types d’endonucléases
Qu’est-ce que les endonucléases de type 1?
- coupent l’ADN à des sites aléatoires qui p e éloignés de 1000 pdb du site de reconnaissance
- complexes SU (modification + restriction)
- ATP dép
Qu’est-ce que les endonucléases de type 3?
- coupent l’ADN à environ 25 pdb du site de reconnaissance
- complexes SU (modification + restriction)
- ATP dép
Qu’est-ce que les endocnucléases de type 2 (ER)?
- en 1970 Par Smith
- PAS ATP dép
- coupent l’ADN dans le site de reconnaissance lui-même
- les séq reconnues ont une taille de 4 à 6 pdb (palindromiques)
Quelles types d’extrémités les endonucléases de type 2 peuvent générer après coupure de l’ADN?
- franches : EcoRV
- cohésives 5’ sortantes : BamHI
- cohésives 3’ sortantes : PstI
=> extrémité toujours 3’ OH/5’ PO4-
Qu’est-ce isoschizomères?
ER d’origines différentes qui coupent tout ou une partie de la même séq
Qu’est-ce que les ER compatibles?
ER libérant des extrémités cohésives complémentaires à un autre site de restriction
Qu’est-ce que l’unité ER?
quantité d’ER capable de couper 1 µg de phage à tous les sites de coupure en 1h dans des conditions optimales
Quels sont les différents tampns des ER?
- NEBuffer 1.1
- NEBuffer 2.1
- NEBugger 3.1
- CutSmart
Qu’est-ce que l’activité aspécifique des ER?
- couper l’ADN à des sites similaires à leur sites de restrictions dans des conditions non standard = activité star
- ex syst de méthylation de E.Coli (Dam/Dcm et EcoKI)
Qu’est-ce que les ADN ligases?
- catalysent la formation d’une liaison phosphodiester entre l’extrémité 3’OH et 5’P adajcente
- ATP dép
- Ligase + connue : T4
De quoi dépend l’efficacité des ADN ligases?
- concentration en ADN
- ration entre plasmide et insert (pdb)
- clonage
- nature des extrémités
A quoi sert la phosphatase?
- déphosphoryler le 5’ P
- ADN ligases ne peuvent pas agir = pas de ligation = pas de circularisation
- connue : CIAP
A quoi sert l’ADN pol thermostable?
- PCR (taq pol)
- PCR sur colonnie
- marquages sondes de PCR
- clonages par PCR
Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage ?
ADN extra-chromosomique de petite taille, rentrant dans la C, et possède sa propre origine de réplication
Quelles sont les caractéristiques des vecteurs de clonage?
- ORI
- MCS (avec sites de restrictions uniques)
- marqueurs de sélection (gène de résistance)
- marqueur de clonage
Ex: pBR (plasmid Boliver et Rodriguez)
Qu’est-ce que les vecteurs d’expression?
- possèdent séq pour réguler la transcription et la trad
- promoteur de trans
- séquence de term
- opérateur (régulation)
- site de fixation du ribosome
Qu’est-ce que la PCR?
- réaction de polymérisation en chaine
- 3 étapes
Quelles sont les étapes de la PCR?
- dénaturation 95°
- amplification 60°: dénaturation+hybridation+extension
- polymérisation 70°
A quoi correspondent les banques d’ADNc?
- séquençage d’ADNc de gènes de protéines d’un grand nbr d’orga
- clones conservés dans des banques
Quelles sont les étapes de clonage?
- gène amplifié par PCR
- produit PCR cloné dans un vecteur
- vérification par séquençage
- gène sous cloné dans plusieurs vecteurs d’expression
Quelles sont les stratégies de clonage?
- ER
- TA-clonage
- TOPO cloning
- LIC (Ligation)
- recombinaison
Comment choisir les amorces pour une PCR?
- séquence 3’ critique
- longueur de 18 à 30 pdb
- T° de fusion > 60°
- contenu en GC entre 40 et 60%
Quelles sont les caractéristiques des polymérases pour un réaction de PCR?
- stabilité thermique pour la dénaturation = pas de perte d’activité
- taux d’extension : vitesse d’extension à 4kb/min
- fidélité : la fréquence de nt incorrect incorporé
- processivité : probabilité que la pol se détache
Comment faire un clonage par des ER?
- préparation du vecteur (digestion et desphophorylation + purification du vecteur)
- préparation de l’insert (digestion avec 2 ER différentes et purification de l’insert)
- ligation (ADN ligase T4)
