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L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules > Cours 3 > Flashcards

Cours 3 Flashcards

1
Q

Sur quel principe est basé la coloration à l’argent?

A

la réduction des ions d’argent

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Q

Quelles sont les étapes de la coloration à l’argent?

A
  • le gel est fixé (immobilise les protéines + enlève les composés qui interfèrent)
  • incubation du gel (fixation de l’Ag avec les protéines et réduction de la fixation du gel) = SENSIBILISATION
  • imprégnation des ions Ag
  • signal de coloration au cuivre par réduction des Ag
  • le développement est arrêté par le bruit de fond
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Q

Sur quel principe est basé la coloration inverse au zinc ?

A

propriétés des protéines qui vont fixer et séquestrer les ions Zn2+ dans un milieu (précipitation imidazole + Zn = Znlm2)

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Q

Quels sont les avantages de la coloration inverse au zinc ?

A

cations métallique pour colorer rapidement les prot, sans fixation, ni colorant orga

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5
Q

Quels sont les avantages de la coloration aux sondes fluorescentes?

A
  • très sensible

- offre un gamme de réponse linéaire (10 à 100 x plus importante que la colorimétrie)

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6
Q

Quels sont les inconvénients de la coloration aux sondes fluorescentes?

A
  • disposer d’un appareillage adéquat
  • source lumineuse monochromatique
  • filtre (sépare les longueurs d’excitations + émission)
  • syst de détection
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7
Q

Quelles sont les 2 types de sondes ?

A

1- sondes fluorogéniques : intésité du signal augmente par co-localisation avec les protéines
2- sondes intrinsèques fluorescentes : lient sélectivement les prot (et pas le gel)

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8
Q

Comment détecter les modif post-traductionnelles?

A
  • détection par phosphorylation
  • détection par les glycoprotéines
  • détection des O-GlcNAc
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9
Q

Qu’est-ce que la détection des phosphorylations?

A
  • permet de détecter les modif post-trad

- sonde dont une partie se lie au P couplé à un fluorochrome

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10
Q

Qu’est-ce que la détection de glycoprotéines?

A
  • détecte les modif post-trad

- oxydation périodique du glycol + conjugaison hydrazide ( méca de base de Schiff)

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11
Q

Qu’est-ce que la détection des O-GlcNAc ?

A
  • permet la détecttion des modif post-trad

- cyclo addition de Huisgen catalysée par le cuivre entre azide et alkyne

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12
Q

A quoi sert le WesternBlot?

A

suivre la purification de prot sans act enzymatique

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13
Q

Quand le WesterBlot est - il utilisé?

A

premières étapes de la purification

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14
Q

A quoi faut-il faire attention avant de faire une purification (WesternBlot)?

A

coloration des gels par le bleu de Coomassie

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15
Q

Quelles sont les étapes de la révélation du WesternBlot?

A
  • bloquer la membrane avec des prot aspécifique
  • AC primaire + AC sec
  • lavage
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16
Q

A quoi doit-on faire attention pour l’AC secondaire ?

A

doit être couplé à une péroxydase : dégrade le substrat + génère la prod de photon + apparition locale de coloration

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17
Q

Dans quels cas l’électrophorèse 2D est utilisée ?

A

mélanges complexes (lysat cell ou fractions sub cell)

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18
Q

A quoi sert l’électrophorèse?

A
  • séparer plusieurs centaines de prot

- séparer les isoformes d’une prot

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19
Q

Quelles sont les étapes de l’électrophorèse 2D?

A

1- séparation en f° charge

2- séparation en f° du PM

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20
Q

Qu’est-ce que la focalisation isoélectrique (IEF)?

A

méthode de séparation des molé amphotères en f° de leur charge

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21
Q

Comment préparer l’échantillon pour une IEF (focalisation isoélectrique)?

A
  • haute [chaotrope] : urée
  • détergent neutre
  • réducteur de thiol
  • ampholyte porteur
  • absence d’autres ions
  • forte résistance aux champs elec (I faible)
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22
Q

A quoi sert le chaotrope dans la préparation de l’échantillon de IEF (focalisation isoélectrique) ?

A

casser les liaisons H + interactions hydrophobes entre ET au sein des prot

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23
Q

A quoi sert le détergent dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?

A

casser les interactions hydrophobes

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24
Q

A quoi sert le réducteur de thiols dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?

A

casser les ponts disulfures

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25
Q

A quoi sert l’ampholyte porteur dans la préparation des échantillons de IEF (focalisation isoélectrique)?

A

augmenter le pouvoir tampon + force ionique

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26
Q

De quoi est composé les tampons amphotères?

A

Ampholines : mélange d’acides oligo-amino + oligo-carboniques aliphatiques

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27
Q

Quel est le gradient de pH pour les tampons amphotères?

A

compris entre 3 et 10

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28
Q

Comment fonctionnent les tampons amphotères?

A

Les composés acides aliphatiques ont un fort pouvoir tampon + forment un gradient de pH (avec un champ électrique)

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29
Q

Comment est crée le gradient de pH immobilisé (IPG)?

A

groupements acides/basiques copolymérisés avec une matrice polyacrylamide

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30
Q

Comment crée un gradient de pH?

A

moins de 10 dérivés différents

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31
Q

Quelles sont les étapes de l’IEF (focalisation isoélectrique)?

A 
1- réhydrater l'IPG (pH immobilisé)
2- positionner le Manifold
3- transférer le IPG vers le Manifold
4- humidifier + assembler les électrodes
5- mettre les échantillons
6- lecture dans l'Etan IPGphor3
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32
Q

A quoi sert la DIGE (Difference Gel Electrophoresis)?

A
  • marquer des différents échantillons avec des sondes fluorescentes différentes
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33
Q

A quoi servent les sondes fluorescentes ?

A

détecter + quantifier les prot dans les gels

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34
Q

Pourquoi utiliser des sondes fluorescentes pour la DIGE?

A
  • sont aussi sensibles que la coloration à l’Ag

- gamme de réponse linéaire

35
Q

Quelles sont les étapes de la DIGE?

A
  • marquage des échantillons avec différentes sondes fluorescentes
  • mélanger les échantillons
  • séparation sur gel 2D
  • analyse d’image
36
Q

Quelle partie utilise-t-on pour séquencer un peptide?

A

N-ter

37
Q

Quels sont les 3 réactifs permettant d’identifier la partie N-ter d’un peptide (pour le séquencer)?

A
  • FDNB (Sanger)
  • Dansyl chloride
  • Dabsyl chloride
38
Q

Quel est le principe de la dégradation d’Edman

A
  • Polypeptide + Phenylisothio cyanate
  • Phe s’accroche en N-ter + clivage du peptide (chaine latérale)
  • détection de Phe en N-ter
39
Q

Quels sont les avantages de la dégradation d’Edman pour la séquençage du N-ter?

A
  • séquençage automatique (sur le sequenator)
  • tech sensible (qqs pg)
  • bon rendement > 99%
  • lecture max 50 aa
40
Q

Quelles sont les étapes de séquençage des polypeptides?

A
  • casser les pont disulfures
  • coupure chimique ou enzymatique
  • purification des peptides
  • séquençage de chaque peptide
  • mise en ordre
41
Q

Quelles sont les différentes techniques de séquençage des polypeptides?

A

1- hydrolye et séparation
2- réaction avec le FDNB, hydrolye et séparation
3- casser les ponts disulfures (si présents), séparation, dégradation d’Edman
4- établir la séquence

42
Q

A quoi sert la spectrométrie de masse?

A

déduire la masse précise d’une molé sous l’influence d’un champ élec ou magnétique (à vide)

43
Q

Quelles sont les 2 méthodes de spectrométrie de masse?

A
  • MALDI MS

- ESI MS

44
Q

A quoi sert l’EMI MS?

A
  • spectro de masse
  • donne un nbr varaible de protons
  • affiche des pics avec un incrément de charge de 1 et de masse 1 (1 proton)
45
Q

Quelles sont les étapes de la MS en tandem (spectro de masse)?

A
  • isolement d’un type de peptide par une MS
  • sélection + fractionnement des peptides (1 coupure/pept)
  • un des deux peptides possède une charge qui sera détectée
46
Q

De quoi est composé le lot de pics des spectres MS/MS?

A

de tous les fragments chargés produits par la cassure du même type de liaison + même côté

47
Q

Que représente chaque pic dans les spectres MS/MS?

A

1 aa de moins que le pic précédent

48
Q

Comment identifier l’aa perdu entre chaque pic du spectre MS/MS?

A

différence de masse entre les peptides (prb : Leu et Ile)

49
Q

Qu’est-ce qu’une enzyme?

A
  • participe à une réaction chimique en augmentant
  • augmente la vitesse
  • n’apparait pas dans les produits
50
Q

qu’est-ce que la constante de proportionnalité (k+2)?

A

étapes de ES à P

pseudo ordre 1

51
Q

A quoi correspond le kcat?

A

nombre de turnover = nbr max de molé de S converties en P/site actif/tps

52
Q

Qu’est-ce que l’état quasi-stationnaire? Que permet-elle de calculer?

A
  • vitesse de réaction est cst
  • [ES] ne varie pas
  • constante Michealis-Menten (Km)
53
Q

Comment mesurer l’AS d’une réaction enzymatique?

A

test basé sur la capacité à faire la distinction entre les prop. physicochimiques du S et du P (de manière quantifiable)

54
Q

Quels tests effectuons nous pour mesurer l’activité d’une enzyme?

A
  • test continu
  • test continu couplé
  • test discontinu
  • test radiométrique
55
Q

En quoi consiste un test continu?

A
  • capacité à mesurer en continu la disparition d’un S ou l’apparition d’un P
  • basé sur de la spectro (absorption UV ou émission de fluorescence)
56
Q

En quoi consiste le test continu couplé?

A

Quand le S n’a pas de prop spectro, il faut ajouter des E en plus pour coupler = prop spectro
(ex: NADH)

57
Q

En quoi consiste le test discontinu?

A
  • le réaction E est stoppée manuellement
  • séparation de S (95%)
  • quantification par intervalle de temps (radiométrique)
58
Q

En quoi consiste le test radiométrique?

A
  • noyau instable de radio-isotope subit une décroissance pour former un isotope stable = béta-émission
  • comptage à scintillation d’émission des béta particules = détermine la radioA (cpm)
59
Q

Qu’est-ce que les endonucléases de restrictions?

A
  • coupent l’ADN viral en laissant intégre l’ADN bactérien protégé par des méthylations
  • découvertes par Werner Arber 1960
  • sont synthétisées à partir de bactéries
  • 3 types d’endonucléases
60
Q

Qu’est-ce que les endonucléases de type 1?

A
  • coupent l’ADN à des sites aléatoires qui p e éloignés de 1000 pdb du site de reconnaissance
  • complexes SU (modification + restriction)
  • ATP dép
61
Q

Qu’est-ce que les endonucléases de type 3?

A
  • coupent l’ADN à environ 25 pdb du site de reconnaissance
  • complexes SU (modification + restriction)
  • ATP dép
62
Q

Qu’est-ce que les endocnucléases de type 2 (ER)?

A
  • en 1970 Par Smith
  • PAS ATP dép
  • coupent l’ADN dans le site de reconnaissance lui-même
  • les séq reconnues ont une taille de 4 à 6 pdb (palindromiques)
63
Q

Quelles types d’extrémités les endonucléases de type 2 peuvent générer après coupure de l’ADN?

A
  • franches : EcoRV
  • cohésives 5’ sortantes : BamHI
  • cohésives 3’ sortantes : PstI
    => extrémité toujours 3’ OH/5’ PO4-
64
Q

Qu’est-ce isoschizomères?

A

ER d’origines différentes qui coupent tout ou une partie de la même séq

65
Q

Qu’est-ce que les ER compatibles?

A

ER libérant des extrémités cohésives complémentaires à un autre site de restriction

66
Q

Qu’est-ce que l’unité ER?

A

quantité d’ER capable de couper 1 µg de phage à tous les sites de coupure en 1h dans des conditions optimales

67
Q

Quels sont les différents tampns des ER?

A
  • NEBuffer 1.1
  • NEBuffer 2.1
  • NEBugger 3.1
  • CutSmart
68
Q

Qu’est-ce que l’activité aspécifique des ER?

A
  • couper l’ADN à des sites similaires à leur sites de restrictions dans des conditions non standard = activité star
  • ex syst de méthylation de E.Coli (Dam/Dcm et EcoKI)
69
Q

Qu’est-ce que les ADN ligases?

A
  • catalysent la formation d’une liaison phosphodiester entre l’extrémité 3’OH et 5’P adajcente
  • ATP dép
  • Ligase + connue : T4
70
Q

De quoi dépend l’efficacité des ADN ligases?

A
  • concentration en ADN
  • ration entre plasmide et insert (pdb)
  • clonage
  • nature des extrémités
71
Q

A quoi sert la phosphatase?

A
  • déphosphoryler le 5’ P
  • ADN ligases ne peuvent pas agir = pas de ligation = pas de circularisation
    • connue : CIAP
72
Q

A quoi sert l’ADN pol thermostable?

A
  • PCR (taq pol)
  • PCR sur colonnie
  • marquages sondes de PCR
  • clonages par PCR
73
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage ?

A

ADN extra-chromosomique de petite taille, rentrant dans la C, et possède sa propre origine de réplication

74
Q

Quelles sont les caractéristiques des vecteurs de clonage?

A
  • ORI
  • MCS (avec sites de restrictions uniques)
  • marqueurs de sélection (gène de résistance)
  • marqueur de clonage
    Ex: pBR (plasmid Boliver et Rodriguez)
75
Q

Qu’est-ce que les vecteurs d’expression?

A
  • possèdent séq pour réguler la transcription et la trad
  • promoteur de trans
  • séquence de term
  • opérateur (régulation)
  • site de fixation du ribosome
76
Q

Qu’est-ce que la PCR?

A
  • réaction de polymérisation en chaine

- 3 étapes

77
Q

Quelles sont les étapes de la PCR?

A
  • dénaturation 95°
  • amplification 60°: dénaturation+hybridation+extension
  • polymérisation 70°
78
Q

A quoi correspondent les banques d’ADNc?

A
  • séquençage d’ADNc de gènes de protéines d’un grand nbr d’orga
  • clones conservés dans des banques
79
Q

Quelles sont les étapes de clonage?

A
  • gène amplifié par PCR
  • produit PCR cloné dans un vecteur
  • vérification par séquençage
  • gène sous cloné dans plusieurs vecteurs d’expression
80
Q

Quelles sont les stratégies de clonage?

A
  • ER
  • TA-clonage
  • TOPO cloning
  • LIC (Ligation)
  • recombinaison
81
Q

Comment choisir les amorces pour une PCR?

A
  • séquence 3’ critique
  • longueur de 18 à 30 pdb
  • T° de fusion > 60°
  • contenu en GC entre 40 et 60%
82
Q

Quelles sont les caractéristiques des polymérases pour un réaction de PCR?

A
  • stabilité thermique pour la dénaturation = pas de perte d’activité
  • taux d’extension : vitesse d’extension à 4kb/min
  • fidélité : la fréquence de nt incorrect incorporé
  • processivité : probabilité que la pol se détache
83
Q

Comment faire un clonage par des ER?

A
  • préparation du vecteur (digestion et desphophorylation + purification du vecteur)
  • préparation de l’insert (digestion avec 2 ER différentes et purification de l’insert)
  • ligation (ADN ligase T4)

L3 - Clonage, purification et analyse des macromolécules (8 decks)

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