Cours 10 - Techniques pour étudier les protéines Flashcards
2 avantages et 3 inconvénients des cultures primaires
Cultures primaires
Avantages:
-Plus représentatifs des réalités tissulaires.
-Access aux cellules d’animaux génétiquement modifiés.
Inconvénients:
-Difficile à isoler et faire pousser.
-Faible rendement.
-Coûts plus élevés.
3 avantages et 2 inconvénients des lignées cellulaires
Lignées cellulaires
Avantages:
-Possibilité de production en quantité élevé.
-Disponibilité commercial d’un grand éventail de type
cellulaire.
-Moins dispendieux.
Inconvénients:
-Moins représentatifs des réalités tissulaires.
-Cellules transformées.
C’est quoi la microscopie à épifluorescence
La microscopie à épifluorescence est une technique largement utilisée en biologie et en médecine pour visualiser des structures spécifiques dans des échantillons biologiques à l’aide de fluorophores.
3 avantages et 3 inconvénients de la microscopie
Avantages :
Sensibilité : Permet de détecter des structures spécifiques grâce à des marquages fluorescents ciblés.
Rapidité : Fournit une observation en temps réel.
Compatibilité multi-couleurs : Possibilité d’utiliser plusieurs fluorophores pour visualiser différentes structures en simultané
Inconvénients :
Photoblanchiment : Les fluorophores peuvent perdre leur fluorescence après une exposition prolongée à la lumière excitatrice.
Bruit de fond : Peut être élevé en raison de la fluorescence non spécifique.
Profondeur limitée : Moins efficace pour observer des structures profondes dans des échantillons épais, comparé à la microscopie confocale.
C’est quoi la différence avec le confocal ?
On voit à l’intérieur de la cellule bcp plus précis rajoute axe Z (utilise un laser)
2 inconvénients du confocal ?
Bcp plus cher
plus long (plus lourd en termes de données)
Peut on faire des reconstitutions 3D avec le confocal ?
Ouiii
Quelle est la méthode utilisée pour isoler des cellules en suspension (liquide) ?
FACS
Sur quel type de cellules est plus efficace le FACS ?
Cellules membranaires
C’est quoi la micro-dissection par laser ? un exemple d’utilisation ?
Tu découpes un tissu avec laser par exemple pour isoler des cellules cancéreuses dans un tissu et les comparer avec leur environnement
Explique le principe du Single Cell RNAseq. Le tissu ou on en a deja bcp fait ?
Identification du transcriptome unique dans chaque cellule d’un tissu (via ARNm et donc ensuite les gènes exprimés)
permet de faire des clusters de types cellulaires
Rétine (pck bcp de types cellulaires bien caractérisés avec des marqueurs connus)
comment sont isolées les cellules dans un single cell RNA ses
dans des bulles 1 bulle = 1 cellule (puis lyse puis hybridation ect)
La première étape dans une purification cellulaire ? les 4 types ?
Fractionnement de
la cellule par:
1- Shock osmotique
2- Ultrasons
3- Trituration
4- Homogénéisation
Est ce que les organelles restent intactes lors du fractionnement d’une cellule ?
Oui
Quels sont les critères de séparation de l’ultracentrifugation ?
Ultracentrifugation: separation par taille et densité
Quels sont les critères de séparation de la centrifugation ?
Poids
Les 4 vitesses de centrifugation et ce qu’on récupère dans le culot a chaque fois ?
Basse vitesse : cytosquelette
Moyenne vitesse : mitochondrie/lysosomes
Haute vitesse : microsomes
Très haute vitesse : virus/macromolécules
Comment fonctionne la centrifugation par vélocité (sédimentation) ? Comment peut on obtenir une séparation plus précise ?
Les composant de la cellule
fractionnée vont se déposer en
bandes principalement selon leur poids et leurs forme
en déposant les
homogénats sur un cousin de
sel/sucrose. Pour prévenir le
mélange des couches par convection,
on utilise un gradient de sucrose .
Comment fonctionne la centrifugation par densité ? Types de gradient ?
Les homogénats sont centrifugés à travers un gradient élevé de sucrose ou césium de chlore.
Chaque composent cellulaire descend le gradient et s’arrête à la densité de la solution correspondant à sa propre
densité.
Un flex de la centrifugation par densité ? (isotopes)
Méthode très sensible pouvant séparer les macromolécules qui on incorporé des isotopes plus légères (ie 13C ou 15N).
Dans une chromatographie sur colonne quelles sont les 3 types de matrices ?
ions
gel-filtration
affinité
Dans la CM par ions donne un exemples de matrice positive et neg . De quoi dependent les associations port-matrice ?
(+) DEAE-cellulose
(-) CM-cellulose
Force ionique
pH solution
Le principe de CM gel filtration ?
separation par taille les plus petites restent coincées
CM affinité ?
Le substrat est fixé a la matrice par lien covalent (souvent pck prot qu’on veut detecter enzyme)
Pour voir un purification on point on fait quoi ?
On combine CM ion puis CM taille puis CM affinité
Comment peut on faciliter la purification ou localisation cellulaire ? 3 exemples
Insertion d’un tag
ex : His-tag avec matrice métallique
ex : c-myc-tag avec anticorps
ex : GST-tag avec glutathionne
Comment se passe la purification d’un complexe protéique a l’aide d’un tag ?
On fait prot recombinante GST-Prot on fait CM affinité et on élue avec des protéines qu’on pense être capables d’intéragir avec notre prot ensuite on lave et TADA on a notre complexe protéique
Rôle SDS et b-mercaptoethanol dans electrophorese ?
rend la prot neg
brise les interactions prot-prot en réduisant les ponts S
comment on fait pour mieux séparer les petites protéines sur un gel polyacrilamide ?
On augmente sa concentration
2 solutions pour révéler les prot sur un gel
Coomassie
Nitrate d’argent
Comment fonctionne la séparation de protéines selon le point isoélectrique en 2D
1er séparation selon la charge intrinsèque de la protéine (dans tampon avec détergeant nonionic)
avec b−mercaptoethanol et urée. La séparation se fait selon un gradient de pH
(isoelectric focusing): le polypeptide se déplace jusqu’au pH où il n’a plus de charge.
2e séparation: électrophorèse (avec SDS selon la taille) à angle droit à la première séparation.
Limite de séparation de protéines selon le point isoélectrique en 2D ?
Séparation possible de jusqu’à 2000 protéines.
Est ce que dans la séparation de protéines selon le point isoélectrique en 2D on sait quelle prot on obtient ? quel expérience complémentaire on peut faire pour découvrir?
nonnn
Spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
Résume en 5 étapes MALDI-TOF
Résumé des étapes de la spectrométrie MALDI-TOF :
-
Préparation de l’échantillon (Matrix-Assisted) :
- Fragmentation des protéines (ex. : par trypsine) en peptides.
- Mélange avec un acide organique cristallisé sur une matrice métallique ou en céramique.
-
Ionisation (Laser Desorption) :
- Un laser vaporise l’échantillon, projetant les peptides sous forme de gaz ionisé.
- Les molécules acquièrent des charges positives.
-
Accélération :
- Les ions sont accélérés dans un champ électrostatique à haute tension vers le détecteur.
-
Temps de vol (Time of Flight) :
- Le temps de vol des ions dépend de leur rapport masse/charge (m/z) :
- Peptides lourds volent lentement.
- Peptides fortement chargés volent plus vite.
- Le temps de vol des ions dépend de leur rapport masse/charge (m/z) :
-
Analyse des données :
- Les temps de vol sont comparés à une base de données contenant les masses des protéines et de leurs fragments pour identifier les peptides.
Comment fonctionne la Co-immunoprécipitation ? un truc important à respecter concernant le Milieu et les tampons utilisés?
T’As deux prots que tu soupçonnes d’intéragir ensemble tu mets un AC dirigé contre une seule des deux (prot A) ensuite tu fais une CM (affinité) qui va retenir l’AC lié à la prot A qui s’est liée a la prot B si elles interagissent. Ensuite tu fais un western blot mais qui est dirigé contre la prot B donc pas celle ou on est deja sur qu’elle est la et si y’a interaction A-B alors une bande sur la mb
INTERDIT DE METTRE DES CONDITIONS DÉNATURANTES TYPE SDS OU B-MERCAPTOETHANOL ECT
Explique le déroulement de l’essai qui testent les interactions protéine-protéine in vitro appelé Pull-Down Assay en 4 étapes
- Construction des protéines hybrides
Principe :
Une séquence codant pour une protéine d’intérêt (ex. : A ou B) est fusionnée à un tag GST (Glutathione S-Transferase) pour faciliter la purification et l’étude des interactions.
Cette construction est exprimée dans une cellule hôte, généralement E. coli, pour produire les protéines hybrides. - Purification des protéines hybrides
Les protéines hybrides (ex. GST-A et GST-B) sont purifiées en utilisant une colonne contenant une matrice de glutathion fixée.
La liaison entre le GST et le glutathion permet de retenir les protéines hybrides dans la colonne, tandis que les impuretés sont éliminées par lavage. - Clivage et purification de la protéine cible
Les protéines d’intérêt (ex. protéine B) peuvent être libérées de leur tag GST en utilisant une enzyme spécifique (ex. thrombine ou autre site de clivage prévu).
Après clivage, la protéine d’intérêt est récupérée pure, séparée du GST et des contaminants. - Détermination de l’interaction entre A et B
La matrice de glutathion contenant la protéine GST-A est utilisée pour tester si elle peut retenir la protéine B :
Si B interagit avec A, elle reste liée à la matrice après lavage.
Si B n’interagit pas avec A, elle est retrouvée dans le surnageant.
L’analyse du surnageant et des fractions liées est effectuée par SDS-PAGE pour déterminer si une interaction a eu lieu.
Sur quoi est basé l’approche dites du mutant dominant négatif
L’APPROCHE DITE DU MUTANT DOMINANT NÉGATIF EST BASÉE SUR
L’OBSERVATION QUE BEAUCOUP DE PROTÉINES SONT CONSTITUÉES
DE DOMAINES QUI SE REPLIENT DE FAÇON INDÉPENDANTE
Comment fonctionne l’approche mutant dominant négatif ?
LE PRINCIPE CONSISTE À EXPRIMER DANS UNE CELLULE UN DOMAINE PROTÉIQUE QUI VA BLOQUER LA FONCTION DE LA PROTÉINE ENDOGÈNE
Explique le fonctionnement de la résonance plasmon de surface (SPR) 3 étapes
Préparation de la surface :
Une molécule (protéine, ligand, ADN, etc.) est immobilisée sur une fine couche métallique (généralement de l’or).
Injection d’un analyte :
Une solution contenant une molécule cible (ex. : un récepteur ou un ligand) est injectée au-dessus de la surface fonctionnalisée.
Détection de l’interaction :
Si les deux molécules interagissent, cela modifie l’indice de réfraction près de la surface métallique.
Cette interaction provoque un changement de l’angle de résonance détecté par le système optique.
Dans la SPR qu’est ce qui est nécessaire de faire pour savoir que l’nteraction est bien spécifique ?
Vérifier la dissociation du complexe avec tampon
A quoi sert le FRET ?
Le FRET (transfert d’énergie par résonance de fluorescence) est une technique qui permet d’étudier les interactions moléculaires à courte distance (1-10 nm) en mesurant le transfert d’énergie entre deux molécules fluorescentes (fluorophores).
Comment fonctionne le FRET ? (3)
Étiquetage :
Deux molécules (ex. : protéines, fragments d’ADN) sont marquées par des fluorophores différents : un donneur et un accepteur.
Excitation :
Une source lumineuse excite le fluorophore donneur.
Détection :
Si le donneur et l’accepteur sont proches et en interaction, la fluorescence de l’accepteur est détectée.
Si le donneur et l’accepteur ne sont pas en interaction, seule la fluorescence du donneur est mesurée.
les deux faits qui différencient BRET de FRET
Dans BRET on a besoin d’un substrat qui va activer la luciférase et aussi pck ici le receveur cest de la GFP (bioluminescence)
C’est quoi les quantum dots
ils absorbent la lumière bleu et émettent une lumière d’onde (fluo) qui dure longtemps.
Plus le dot est gros plus la longueur d’onde d’emission est longue
Comment fonctionne la ChIp ?
on lie ADN et des facteurs de transcription avec formaldehyde puis on lyse la cellule et on met une nuclease qui va couper l’ADN partout sauf la ou y’a des FT sur l’ADN.
On fait précipité ce complexe avec des AC ciblant le FT et on enlève le formaldéhyde pour garder uniquement ADN. Ensuite on fait PCR pour amplifier cet ADN et on sequence.
3 trucs qu’on peut faire avec une souris transgénique ?
remplace un gene
K.O. un gène
ADD un gène
Grâce a quel système on peut faire des souris transgéniques? deux variantes de ce système ?
Cre-Lox
tissu spécifique avec promoteur pour la cellule en question
time specific avec tamoxifen
