Clonación y transformación Flashcards
¿Por qué clonar?
Para aislar células con propiedades específicas (las céulas no especializadas tienden a dominar el cultivo)
Clonar es fácil tanto para cultivos primarios como para líneas celulares continuas
FALSO: clonar es fácil para líneas continuas y dicidil para cultivos primarios
En qué tipo de superficie se pueden clonar células adherentes
Cajas petri
Placas multipozos
Botellas de cultivo
Por qué utilizar una matriz viscosa para clonar por suspención?
La matriz viscosa (Methocel) asegura que las células hijas permanezcan en las colonias.
Células hamatopoyéticas se clonan por suspención
Cuál es el fundamento de clonar en suspención?
Observar que las células diluidas a cierta densidad pueden formar colonias
Por qué es necesario tripsinizar a las células y como terminas la reacción de la tripzina ?
Para asegurar una suspención homogénea, para terminar la reacción, es necesaro agregar SFB (5mL)
Cual es el protocolo para clonar por dilución?
- Tripsinizar las células
- Contar las células y diluir a 1x105 células/mL
- Diluir las células a 10 células/mL
- Cultive 0.1 mL en una placa de 96 pozos
- Espere una semana, esperar que las clonas sean visibles
Razones para tener baja eficiencia de sembrado
- Pérdida por filtración
2. Los factores derivados solubles de las células están muy diluidos
La selección de un medio enriquecido, añadir hormonas, un sustrato adecuado y el uso de un medio condicionado son utilizados para:
Incrementar el crecimiento clonal
Las células nodrizas son:
Son células que simulan altas concentraciones celulares, pueden proveer de nutrientes, factores de crecimiento y matriz extracelular
Son características del Methocel
Las colonias son mantenidas juntas, no hay impurezas y es fácil de manipular.
Las colonias forman una interface entre el methocel y la capa de agar
Protocolo para Methocel
- Prepara una capa de 0.6 % Agar
- Diluir de Methocel con medio 1x, mantener en hielo
- Preparar las diluciones celulares
- Adicionar 40 uL de cada dilución a los tubos marcados + 4 mL de Methocel, Vortexear
- Usar una jeringa y adicionar 1mL de cada dilución a las placas
- Incubar hasta que las colonias se formen
Cómo se aislan las células adherentes?
Uso de tripzina (placa multipozos)
Uso de anillos (cerámica, acero, plástico) para separar colonias (en caja petri)
Proliferación v/s diferenciación
Proliferación
La entrada en el ciclo de división celular es regulada por señales ambientales.
Factores de crecimiento (EGF, PDGF o FGF) son necesarios
Diferenciación
Crecimiento inhibido en cultivos de alta densidad.
Proteínas intracelulares como p53 y Rb inhiben la proliferación.
Evento o serie de eventos dependientes que promueven la inestabilidad genética
Transformación
Al transformar células, qué propiedades de la célula son alteradas?
Velocidad de crecimiento, forma de crecimiento, producción de productos especializados, longevidad y tumorigenicidad
Son métodos para transformar:
Introducción artificial de DNA o transferencia de DNA en células mamíferas (transfección)
la infección con virus o trasnfección de genes mutantes de ras, radiación ionizante o carcinógenos químicos.
La inmortalización, el control aberrante del crecimiento (la pérdida de la inhibición por contacto) y la malignidad (crecimiento de tumor invasivos) son :
Los tres principals clases de cambios fenotípicos
Las líneas celulares finitas humanas son genéticamente inestables mientras que las líneas celulares de ratón son genéticamente estables y se transforman dificilmente
FALSO
¿Cómo se determinan las aberraciones cromosómicas?
Por el ensayo de intercambio de cromátides hermanas, en el conteo de cromosomas y el análisis del cariotipo.
sufren cambios después de la 12va generación
Las células de roedores
Para que las células de ratón permanezcan sensibles a la inhibición por contacto se deben de
Mantener a una densidad baja y no se les permite llegar a la confluencia por un periodo de tiempo largo
Los genes de senescencia en líneas celulares finitas controlan negativamente el ciclo celular y su progresión
VErdadero
Inmortalización involucra tanto inactivación de senescencia y reguladores del ciclo celular como:
pRb y p53
Permite un tiempo de vida extendido y restringe la actividad de genes de vigilancia del DNA,
Incrementa la inestabilidad genómica y
Incrementa las oportunidades para las mutaciones
Inmortalización
Agentes virales para inmortalizar células y cuáles genes afectan:
Virus SV 40, Adenovirus (E 1a), VPH E6 y E7, Epstein-Barr virus (EBV)
pRb, p53 y p16 (principalmente)
Son subunidades de la telomerasa
El componente de RNA (hTR)–> es expresada en tejido normal y maligno
y la subunidad proteica catalítica (hTERT) –> expresada en tumores, líneas celulares germinales y linfocitos activados
Transfectar células con hTERT extiende la vida media de la línea celular
Son características de un control alterado del crecimiento
·líneas celulares tumorigénicas lo muestran.
·baja dependencia del suero o de factores de crecimiento.
·clonas con una alta eficiencia de sembrado
“·control autónomo del crecimiento: secretan sus propios mitógenos y sus receptores” –> Producen Interleucinas 1, 2 y 3 junto con factores estimuladores del crecimiento de colonias (CSF)
Por qué las células transformadas tienden a crecer en suspensión?
La transformación conduce a modificaciones en la glucoproteínas de superficie y las moléculas de adhesión.
Conduce a una pérdida del reconocimiento célula- célula, desorganiza los patrones de crecimiento, la pérfida de la inhibición por contacto y la limitación de la proliferación por densidad.
Están permanentemente activos y son difíciles de manejar además que sobreexpresan de genes que regulan la transducción de señales (cinasa Src ) o controladores de la transcripción (myc, fos y jun)
Oncogenes
Tienen una tasa de crecimiento alta, reducida dependencia al anclaje, pronunciada aneuploidia e inmortalización
Tumores malignos
Cuando las células han desarrollado la capacidad de generar tumores invasivos implantados in vivo en huéspedes autológos o si son trasplantadas como xenotransplantes en un animal deprivado de inmunidad se dice que es:
Tumorigenicidad por malignidad
Son características de Tumorigenicidad por angiogénesis
Células secretan factores (VEGF, EGF-2 y angiogenina) capaces de la neovascularizar
Las células tumorales producen enzimas proteolíticas que ayudan a las células tumorales a no adherirse a ninguna superficie (invasión a otros tejidos)
