Chapitre 6 - Observations des microorganismes Flashcards
Robert Hooke
- Microscopes composés
- terme “cellule”
Antoni Van Leeuwenhoek
- lentilles bonnes qualité (300x)
- Animalicules
Unités et échelles de grandeur
Micromètre (um) et nanomètre (nm)
Longueur d’onde
- Lumière blanche contient toutes les couleurs de la lumière visible
Interactions de la lumière avec un objet
- Réflexion
- Absorption
- Transmission
- Diffraction
Réflexion
Onde rebondit, donne la couleur
Absorption
Énergie gardée par l’objet, lumière émise de nouveau (fluorescence)
Transmission
Passage de la lumière à travers des objets
Diffraction
- Déviation ou courbure des rayons lumineux lors de leur passage à travers une ouverture de petite taille
- Problème en microscopie ! Les lentilles créent un tel effet, le grossissement maximal associé à une lentille est de 100X
Réfraction
- Changement d’angle de la lumière en fct de la densité
- indice de réfraction
- diminution du diamètre de la lentille
- problème en microscopie – solution: utilisation de l’huile à immersion qui possède le meme indice que le verre
Résolution
-Capacité d’une lentille à présenter les objets distinctivement, sans chevauchement
- lié à la longueur d’onde de la lumière
- ouverture numérique d’une lentille
Concept de grossissement
- grossissement total d’un spécimen observé est déterminé en multipliant le grossissement des oculaires par celui de l’objectif
- grossissement des oculaires = 10x
Types de microscopes
- Optique: énergie du spectre lumineux et des lentilles
- Électronique: Faisceau d’électrons et des électroaimants
- À sonde: Utilise le principe du Braille à l’aide d’une sonde et d’un signal électriqee
Microscope à fond clair
- Échantillon plus foncé sur fond brillant
- Spécimens frais et contrastés ou morts et colorés
- grossissement max de 1000-2000x
Microscope à fond noir
- Observation de microorganismes vivants (observer mouvements, impo à colorer)
- Condenseur modifié avec disque opaque (bloquer partie rayonnement lumineux
- spécimen brillant sur fond noir
Microscope à contraste de phase
- observation des structures internes d’organismes vivants (n-fixés, n-colorés)
- Augmente le contraste entre des structures d’épaisseurs variables
- Spécimen avec régions brillantes à noir en passant par le gris
Microscope à fluorescence
-fluorochrome: absorbe lumière UV et émettre de la lumière visible
-filtre d’excitation: retient la lumière visible et laisse passer les rayons UV qui exciteront les fluorochromes sur le spécimen à observer
-Spécimen: échantillon
-filtre d’émission: retient les rayons UV et laisse passer lumière visible
Immunofluorescence?
-Utilisation d’anticorps associés à des fluorochromes
- technique très spécifique (protéine spécifique, microo spécifique)
Microscope électronique
-Idéal pour visualiser spécimen de moins de 0,2um
- non-vivants, longue préparation
- pas de source lumineuse (Faisceau d’é)
- pas de lentilles de verre (électroaimants)
Microscope électronique à balayage (SEM)
- images tridimensionnelles des surfaces
- électrons du spécimen sont renvoyés vers un capteur
- grossissement jusqu’à 10 000x
Microscopie électronique à transmission (TEM)
- Observation d’échantillons très minces
- Électrons passent à travers le spécimen puis atteignent le détecteur
- grossissement 100 000x
Microscope à force atomique
- principe de braille avec une sonde se déplaçant à la surface de l’échantillon (pas lumière ni électrons)
- mesure topographie des objets et construit image
- utilisable en fct du temps et sur du matériel vivant
- grossissement jusqu’à 100 000 000x
Préparation des échantillons (microscope optique)
- Montage frais (liquide): Technique simple, goutte suspendue
- Montage fixe (séché et coloré): séchage à l’air, fixation à chaud, coloration
Colorants
- Colorants acides
- Colorants basiques
Colorants basiques (sels d’ions +)
Ion + est attiré par la bactérie ayant une charge globale -
Colorants acides (sels d’ions négatifs)
- Coloration des structures “positives” ou de l’arrière plan (coloration négative)
Types de coloration
- Simple: basique, morphologie, taille et arrangement
- Différentielle: plusieurs colorants, caractéristiques distinctes
- Structures spécifiques: Coloration endospore, capsule, flagelles
Coloration de gram (différentielle)
Démontre les différences au niveau de la paroi cellulaire
Couleur gram+/gram-
- gram+ = violet
- gram - = rose
alcool chez gram-?
-Passe à travers la membrane, va déloger le cristal violet, donc devient transparente/translucide
- ajouter safranine (devient rose)
Coloration acido-alcoolo résistance
coloration différentielle (fortes liaisons du colorant aux parois riches en lipides)
1- tout le monde est rouge
2- perd coloration
3- rinçage à l’eau
Coloration des endospores
- Difficile pour les colorants de passer la paroi sporale
- Coloration de Shaeffer-Fulton
Coloration de Shaeffer-Fulton
- Frottis fixé
- vert de malachite
- lavage à l’eau
- Contre coloration à la safranine
- dernier lavage à l’eau
- endospore = vert
- cellules végétative = rouge
Coloration négative des capsules
- Utilisation de l’encre de chine ou de nigrosine (colore fond de la lame, coloration simple)
Coloration des flagelles
- Procédé complexe
- Utilisation de mordant pour rendre les flagelles plus épais puis ajout d’un colorant basique
