Chapitre 5 - Immunotechniques Flashcards
Qu’est-ce que le test d’hémagglutination ?
- C’est une très vielle technique
- On incube différentes dilutions d’un anti-sérum avec une quantité constante de GR
- Les GR se déposent différemment dans le puits selon qu’ils sont agglutinées ou pas : le réseau formé par l’agglutination couvre une grande surface au fond du puit
- Pour déterminer le titre de l’anti-sérum, on fait l’inverse de la plus grande dilution donnant une réponse positive.
Explique moi le test d’hémagglutination pour le virus de l’influenza.
- Les GR possèdent des récepteurs d’acide sialique qui reconnaissent les HA présent à la surface du virus de l’influenza.
- La liaison Virus-HA avec récepteur des GR provoquent leur agglutination.
- L’incubation des GR avec un sérum d’une personne qui est vacciner (Ac anti-influenza (Anti-HA)).
- Avec plusieurs dilutions, on est capable de trouver la concentration d’Ac nécessaire pour neutralisé le virus et ainsi éviter l’agglutination des GR.
- Le titre sera la dernière réaction négative
Qu’est-ce que le Latex agglutination test?
- Un test très rapide (~ 1 à 5 minutes), robuste et simple
- Ce test est très semblable à l’hémagglutination mais on utiliser des billes de latex couplées avec l’Ag.
- La présence d’Ac contre l’Ag = agglutination des billes
Qu’est-ce qu’un anticorps primaire ?
c’est un anticorps contre une cible donnée.
Qu’est-ce qu’un anticorps secondaire?
- C’est un Ac anti-anticorps
- Il peut être spécifique aux Ig de lapin, de chèvre, de souris, de rats, etc.
- Il reconnaît la partie Fc de l’Ac primaire
Qu’est-ce qu’un anticorps couplé ?
- C’est un Ac couplé à un agent coloré ou fluorescent
- Il peut aussi être couplé à un enzyme dont l’activité peut être mesurée à l’aide de son substrats qui devient coloré après la réaction
ex: Phosphatase alcaline: réactif incolore à coloré
Explique moi ce qu’est un immunobuvardage de type western (western blot) et les 9 étapes de cette méthode après la migration initiale.
- C’est une technique d’identification de protéine sur un gel SDS-PAGE
Étapes:
1) coloration du gel où la protéine d’intérêt à migré
2) Transfert sur une membrane de PVDF, de nylon ou de nitrocellulose
3) Blocage de la membrane par des protéines non-spécifiques comme le lait en poudre
4) Lavage
5) Incubation avec l’Ac primaire contre la protéine d’intérêt
6) Lavage
7) Incubation avec l’Ac secondaire anti-Ig couplé à une enzyme ou à un fluorophore
8) Lavage
9) Ajout du substrat, révélation et diagnostique.
Souvent on fait 2 gels SDS en parallèle, un coloré et l’autre pour l’immunobuvadage pour permettre la comparaison.
Qu’est-ce que et quel est le principe d’un RIA (Radio-immunoessai) ?
- c’est une technique pour quantifier des protéines
Principe:
- Dans une série de tubes, on incube l’Ac avec une quantité fixe de l’Ag radiomarqué et des quantités croissantes de l’Ag non-marqué
- l’Ag non-marqué entre en compétition avec l’Ag marqué.. ce qui permet de faire une courbe d’étalonnage.
Quelles sont les 4 composantes essentielles pour effectuer une RIA (Radio-immunoessai)?
1) Un Anticorps spécifique pour l’Antigène fixé à un substrat solide
2) Ag pur et radiomarqué (Ex: iode 125)
3) Ag pur et non-marqué, en quantité connu qui va servir de références
4) l’échantillon a analyser
- Pour l’échantillon, on a seulement à faire une réaction de compétition avec l’Ag radiomarqué, le degré de compétition indique la quantité.
Quelles sont les 9 étapes d’un RIA?
1) Dans un puits tapissé d’Ac spécifique, ajouter une quantité fixe d’Ag radio-marqué
2) lavage et calcul de la quantité lié aux Ac
3) Ajouter au même puits, un mélange Ag marqué en quantité fixe avec la quantité #1 Ag non-marqué.
4) Lavage et calcul de la quantité Ag marqué lié aux Ac
5) Ajouter au même puits, un mélange Ag marqué en quantité fixe avec la quantité #2 Ag non-marqué
6) Lavage et calcul de la quantité d’Ag marqué lié aux Ac
7) Faire la courbe d’étalonnage (Y: cpm lié ; X: dose Ag non-marqué) avec les données recueillies aux étapes 2,4 et 6. On sait quelle quantité d’Ag il faut pour “tasser” l’Ag radioactif.
8) Faire une nouvelle réaction avec une dose fixe d’Ag marqué avec l’échantillon à concentration inconnue d’Ag
9) déterminer la quantité d’Ag présent dans l’échantillon en se référant à la courbe d’étalonnage
Qu’est-ce que le titre d’un Anticorps?
- c’est la concentration minimale d’Ac avec lequel on obtient encore une réaction positive dans un essai
- Souvent on indique l’inverse de la dilution maximale positive comme titre
Le titre dépend complètement de l’essai !!!
-la même préparation d’Ac va donner des titres différents dans des essais différents.
Quelles sont les 8 étapes d’un ELISA méthode pas sandwich ?
ELISA = enzyme-linked immunoadsorbant assay
1) Fixé l’Ag à un support solide (fond d’un puits)
2) Lavages
3) Ajout d’un Ac primaire
4) Lavages
5) Ajout d’un Ac secondaire couplé à une enzyme (peroxydase)
6) Lavages
7) Ajout du substrat de l’enzyme
8) Mesure de l’intensité de la coloration
La réaction est quantifiable car l’intensité de la coloration est proportionnel à la quantité d’Ag lié.
Quelles sont les 8 étapes d’un ELISA méthode sandwich ?
1) Fixer l’Ac anti-XYZ sur un support solide (fond du puits)
2) Lavages
3) Ajout de l’extrait cellulaire contenant la protéine XYZ, Ajouter des dilutions différentes à différents puits.
4) Lavages
5) Ajout de l’Ac couplé (qui doit reconnaitre un épitope différent mais sur le même Ag)
6) Lavages
7) Ajout du substrat que l’enzyme peut tranformer
8) Mesure de l’intensité de la coloration
La réaction est quantifiable car l’intensité de la coloration est proportionnel à la quantité d’Ag lié
Comment est-il possible de déterminer la réponse immunitaire d’un patient face à un pathogène donnée?
Souvent on ne chercher pas le pathogène en soit mais on va chercher les Ac développer par le patient contre celui-ci
il suffit de faire une ELISA pas sandwich:
- on purifie l’Ag du pathogène et on le fixe au fond du puits
- Ensuite on ajouter différentes dilutions du sérum patient qui contient les Ac
- Lavages, Ac secondaire couplé et quantification de la réaction
Qu’est-ce que la méthode immunofluorescence?
- on ajoute a un Anticorps soit une molécule coloré (chromophore) ou une molécule fluorescente (fluorochrome).
- La fluorescence est l’absorption d’un photon d’une certaine longueur d’onde et l’émission d’un photon de longueur d’onde plus longue ( moins énergétique)
- La mesure de la fluorescence émise est proportionnel au nombre d’Ac fixé dans la réaction
