Chapitre 2 : Culture et Fractionnement Flashcards
Quel est le but des cultures cellulaires ?
Comprendre le fonctionnement cellulaire
Aider au diagnostic
Créer des outils thérapeutiques
Quel est le but du fractionnement cellulaire ?
Désorganiser les cellules
Isoler les organites
Quelles sont les 2 grandes sources de cellules ?
Les cellules isolées dans les liquides biologiques (ex : sang)
Les cellules d’organes
Quelles sont les 3 étapes d’isolement pour obtenir une cellule eucaryote animale ?
Dissociation (si organes)
Séparation
Mise en culture dans un milieu approprié
Quelles sont les différentes dissociations possibles ?
Par dissection
Par dissociation enzymatique
Par dissociation mécanique
Décrire la dissection (dissociation)
Fragmentation des organes en morceaux de 1 à 4 mm3 = explants
Flacon de culture dans un milieu nutritif
Les cellules vont se multiplier et migrer
Quels sont les inconvénients d’une dissection ?
La lenteur
Le flacon de culture peut être envahi par des cellules non désirées
Décrire la dissociation enzymatique
Tissus en contact avec enzymes protéolytiques qui vont digérer la MEC
Méthode rapide
Quels sont les inconvénients de la dissociation enzymatique ?
Les cellules peuvent être altérées par les enzymes
Quelles sont les enzymes protéolytiques de la dissociation enzymatique ?
La trypsine
La collagénase
La pronase
Décrire la dissociation mécanique
Uniquement pour les tissus mous *
Les tissus sont dilacérés à la pipette par des cycles d’aspiration et de refoulement
Quelles sont les 4 méthodes de séparation de différents types cellulaire ?
La centrifugation
La capacité d’adhérence
La cytométrie en flux
Piégeage par billes magnétiques
Décrire la centrifugation
Séparation en fonction de la taille et de la densité des cellules
Décrire la technique basée sur la capacité d’adhérence
Le verre et le plastique
Des matrices recouvertes d’anticorps spécifiques des types cellulaires que l’on veut isoler
Décrire la cytométrie en flux
Les différents types cellulaires possèdent des molécules (marqueurs de surface distincts)
Cellules spé = reconnues par un anticorps couplé à des agents fluorescents
Les cellules reconnues vont fluorescer
Un détecteur reconnaît la fluorescence et attribut des charges + aux cellules spé
Champ électrique qui isole les cellules spé
Plusieurs milliers e cellules par seconde
Décrire le piégeage par des billes magnétiques
Anticorps spé fixés sur billes magnétiques
Complexe cellule-bille magnétique
Aimant qui retient les cellules reconnues par les billes magnétiques
Lavages successifs
Aimant décroché = récupération des cellules
Quels sont les différents types de culture ?
Les cellules en suspension
Les cellules adhérentes
Les cultures primaires
Qu’est-ce que les cultures de cellules en suspension ?
Pas de support pour survivre
Que certains types de cellules (sanguines, de lignée continue)
Facile à récupérer par simple centrifugation
Qu’est-ce que les cultures de cellules adhérentes ?
Support obligatoire
Verre, plastique traité, plastique recouvert de MEC
Cellules difficiles à récupérer (grattage ou enzymes)
Réalisent une monocouche
Qu’est-ce que les cultures primaires ?
Prélevées des organes puis dissociation et séparation
Mise en culture avec milieu approprié
Prolifération jusqu’à confluence (se touchent)
Inhibition de contact
Comment s’appelle l’étape de prolongement de la culture, où il est nécessaire de prélever les cellules à confluence et de les répartir ?
Le repiquage
A partir du premier repiquage, on ne parle plus de culture primaire mais de ?
De subculture
Quelles sont les caractéristiques des cellules issues de cultures primaires ?
Caractéristiques proches des cellules présentes dans les tissus
Caractère non tumoral
Support obligatoire
Inhibition de contact
Quels sont les inconvénients des cellules issues de culture primaire ?
Perte possible d’expression des gènes
Variation dans l’expression d’un gène
Durée de vie limitée
Faible quantité de cellules obtenues
A quoi oppose t-on les cellules primaires ?
Les lignées cellulaires
Comment sont obtenues les lignées cellulaires ?
Après plusieurs repiquages
Quelles sont les caractéristiques des cellules issues de lignées cellulaires ?
Grande quantité de cellules obtenues
La capacité de se multiplier
Quels sont les 2 types de lignées cellulaires ?
Durée de vie limité
Continues
Qu’est-ce que les lignées cellulaires à durée de vie limitée ?
Nombre de repiquage limité (entre 20 et 80)
Vieillissement
Les cellules se multiplient (sénescence)
Mourir
Qu’est-ce que les lignées cellulaires continues ?
Immortelles Transformation : mutations spontanées ou manipulation génétique Perte de l'inhibition de contact Perte de la dépendance au support caractéristiques des cellules tumorales
Quelles sont les bonnes conditions de culture ?
Apport d’éléments nutritifs
Maintien des conditions physico-chimiques appropriées
Apport de facteurs de croissance
Quelles sont les caractéristiques d’un milieu de culture de base ?
Stérile Constituants minéraux Substances énergétiques AA Vitamines Sérum de veau foetal SVF à 10 ou 20% (hormones, vitamines, facteurs de croissance, fibronectine)
Quelles sont les caractéristiques d’un milieu synthétique non défini ?
Milieu de culture de bas associé au sérum
Addition de sérum
Quelles sont les caractéristiques d’un milieu synthétique défini ?
Milieu de culture de base sans addition du sérum Addition de : Facteurs de croissance Transferrine Albumine Fibronectine ou collagène
A quel niveau se fait le maintien du pH sanguin ?
Entre 7,2 < pH < 7,4
Que peut-on utiliser pour réguler le pH ?
Des systèmes tampons : bicarbonate (alcaliniser) et CO2 ( acidifier)
A quelle température l’enceinte doit être régulée ?
A 38° ou 39°
Fractionnement : quelles sont les 2 étapes pour obtenir les organites ?
Briser les tissus ou les cellules : homogénéisation
Isoler les organites : isolement
Qu’entraîne l’étape d’homogénéisation ?
La rupture des membranes de certains organites
Lors de l’homogénéisation, quels organites ne perdent pas leur membrane ?
Le noyau et les mitochondries
Quel est le principe de l’homogénéiseur ?
On applique un cisaillement au matériel biologique en le faisant passer au travers d’un espace très fin
Quel est le principe du broyeur ?
Le déchiquetage des tissus grâce à des lames rotatives qui tournent à grande vitesse
Quel est le principe de la sonication ?
Une tige métallique qui est plongée dans le liquide contenant les cellules isolées qui émet des ultrasons qui vont provoquer la lyse des cellules
A combien de degrés se font les cycles de congélation-décongélation ?
- 20°C
Par quoi sont représentées les vitesses de sédimentation ?
Par le coefficient de sédimentation, en unités Svedberg
