Biologie moléculaire 2 (PCR) Flashcards
Que veut dire PCR?
Acronyme pour polymerase chain reaction (réaction de polymérase en chaine)
À quoi sert la PCR?
Méthode qui permet de choisir un segment particulier dans un génome et d’amplifier cette séquence cible pour en obtenir des millions de copies
Comment nomme-t-on le segment d’ADN qu’on désire amplifier lors d’une PCR?
Séquence cible
Quel est le nom du chercheur qui a inventé la PCR?
Kary Mullis
Vrai ou Faux: la PCR utilise des caractéristiques de la double hélice de l’ADN
Vrai
Est-il possible pour les 2 brins d’ADN de se réassocier entre eux après une dénaturation? Si oui, comment?
Oui, si la température redescend ils peuvent se réassocier entre eux
Vrai ou Faux: les petits fragments d’ADN ont plus de facilité à se réapparier
Vrai
Décrire l’ADN polymérase en 3 points
1- enzyme qui catalyse la synthèse d’un brin complémentaire à partir d’un ADN gabarit
2- présente chez tous les eucaryotes et procaryotes
3- essentielle à la réplication de l’ADN
Vrai ou Faux: la synthèse d’ADN par l’ADN polymérase se fait TOUJOURS dans le sens 3’ vers 5’
Faux, c’est toujours dans le sens 5’ vers 3’
Qu’est-ce qu’une amorce?
Courte séquence d’ADN qui sert de point de départ pour la synthèse d’ADN
Quelles sont les étapes d’une réaction PCR?
1) dénaturation = les 2 brins sont séparés par haute T° (95°C durant 30 à 60 secondes)
2) hydratation des amorces = T° redescend, les amorces se reapparient (30 à 60 secondes)
3) élongation = l’ADN polymérase utilise la complémentarité des bases pour allonger une amorce appariée au brin gabarit (72°C )
ET
étape de polissage à la fin pour s’assurer que tous les brins synthétisés sont bels et biens complétés
Vrai ou Faux: lors de l’hydratation des amorces, la température d’appariement dépend de la Tm des amorces
Vrai
Vrai ou Faux: lors de l’élongation lors de la PCR, la durée de cette étape dépend de la longueur de la séquence cible
Vrai,
c’est 1kb/min lorsqu’on utilise la Taq polymérase
Quelle est l’utilité d’un thermocycleur?
Il produit les changements de température à chaque cycle lors d’une réaction PCR
Que contient une réaction PCR?
- ADN polymérase thermostable
- tampon
- dNTPs
- amorces forward et reverse
- ADN gabarit
- eau
À quoi sert le tampon dans une réaction PCR?
- il permet de maintenir les conditions optimales de l’enzyme
ex: pH et concentration des sels
Qu’est-ce que des dNTPs?
C’est un mélange de 4 nucléotides
(A-T et C-G)
Ce sont des blocs de construction pour l’ADN polymérase
À quoi servent les amorces forward et reverse lors d’une réaction PCR?
Ces 2 amorces vont se lier spécifiquement aux extrémités de la région à amplifier
Que contient l’ADN gabarit?
ADN contenant la séquence à amplifier
Vrai ou Faux: c’est la découverte des ADN polymérase thermostable qui a permis de faire plusieurs cycles sans ajout d’enzyme lors d’une réaction PCR
Vrai,
En plus, cela limite les chances de contamination et cela facilite la manipulation
Décrire l’ADN polymérase Taq en 3 points
1- est isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus
2- température pour son activité optimale = 72°C
3- résiste aux températures élevées (95°C)
Vrai ou Faux: la polymérase Taq permet de générer des fragments d’ADN ne dépassant pas généralement 4kb
Vrai
Comment se nomme l’ADN amplifié par PCR
amplicon
Vrai ou Faux: la position des amorces délimite la région qui sera amplifiée
Vrai
Vrai ou Faux: les amorces forward et reverse doivent avoir une taille similaire et un Tm similaire
Vrai
Que signifie Tm?
Température de fusion
Qu’est-ce qu’un adaptateur?
Portion d’ADN absente de l’ADN gabarit et qui peut être utilisé pour le clonage
Comment bien choisir les amorces lors d’une réaction PCR?
- les 2 amorces doivent avoir une taille et une Tm similaire
- elles ne doivent pas être trop longues ni trop courtes
- ont une longueur entre 15 à 35 nucléotides
Vrai ou Faux: lors d’une réaction PCR, plus les amorces sont longues, plus l’hybridation est spécifique
Vrai
Qu’arrive-t-il si les amorces sont trop courtes lors d’une réaction PCR?
Elles vont s’hybrider à trop de nombreux sites et on obtiendra plusieurs produits PCR non spécifiques
Comment sont les amorces que nous devons utiliser pour le génome humain ?
Des amorces d’au moins 17 bases
Qu’est-ce qu’une Tm?
Température à laquelle 50% des amorces sont associées à la matrice d’ADN
(température de fusion)
Vrai ou Faux: les liens entre C-G sont plus nombreux que les liens entre A-T donc, il est plus difficile de les séparer puisque cela demande plus d’énergie/chaleur
Vrai
Quel est le calcul pour la Tm?
2°C (nb de A + nb de T) +
4°C (nb de C + nb de G)
Que se passe-t-il si la température d’hybridation est trop élevée ?
Les amorces ne pourront pas s’hybrider
Que se passe-t-il si la température d’hybridation est trop basse?
Les amorces s’hybrideront à d’autres sites
Quelles sont les 2 choses à éviter lorsqu’on choisit les amorces?
1- la présence de séquence complémentaire à l’intérieur d’une même amorce = structure d’épingle à cheveux
2- les 2 amorces ne doivent pas s’associer ensemble mais bien à la séquence cible
Quel est le calcul pour trouver le nombre de copies?
Y = X 2^n
y: nb final de copies
x: nb initial de copies
n: nb de cycles
En observant une courbe standars, du nb de cycle en fonction du nb total de copies, comment le plateau s’explique-t-il?
1) les désoxyribonucléotides s’épuisent
2) l’enzyme est inactivée par des passages successifs à haute température (elle est moins efficace donc la réaction ralentit)
3) les brins d’ADN qui ont été séparés en chauffant peuvent se réassocier avant de se lier aux amorces
Décrire 3 autres application de la PCR?
1- en biologie moléculaire et en recherche
2- dans le domaine médicale
3- en médecine légale
Comment explique-t-on les variations de séquence parmi les individus d’une population?
Par des polymorphismes génétiques
Qu’est-ce que le phénotype?
Caractère visible dans l’apparence d’un organisme ou d’une cellule
Quels sont les 2 types de polymorphismes d’ADN?
1) SNP =
variations ponctuelles dues au remplacement d’un seul nucléotide par un autre
2) polymorphismes de répétitions = variations du nb de répétitions
Vrai ou Faux: les polymorphismes de répétitions sont regroupés selon la longueur du motif répété
Vrai
Quels sont les 2 polymorphismes de répétitions connus?
1) STR = short tandem repeat (microsatellites)
2) VNTR = variable number of tandem repeats (minisatellites)
Comment sont formés les STR?
Par la répétition d’un motif d’ADN long de 2 à 6 nucléotides
Comment sont formés les VNTR?
Par la répétition d’un motif d’ADN long de 16 à 25 nucléotides
Vrai ou Faux: dans le génome humain, les VNTR sont plus nombreux que les STR
Faux, ce sont les STR qui sont plus nombreux que les VNTR
Entre les VNTR et les STR, lesquels sont privilégiés pour l’identification légale d’individus?
STR
Vrai ou Faux: le génome humain est diploïde
Vrai, chaque individu possède 2 allèles (un allèle origine paternelle et un allèle origine maternelle)
Si un individu est homozygote, qu’allons nous voir sur le gel?
Les allèles sont de même taille, une seule bande sera visible
Si un individu est hétérozygote, qu’allons nous voir sur un gel?
Les 2 allèles ne sont pas de même taille, il y aura 2 bandes visibles
