Aula 6 - Isolamento e Purificação de Proteínas

Question 1

Quais os métodos físicos de lise?

Answer 1

Choque osmótico - adicionar água 
choques térmicos - congelar e descongelar
choques mecânicos
Sonicação (ultra-sons)
Descomprssão explosiva

Question 2

Quais os métodos de purificação?

Answer 2

Pré-purificação
centrifugação (para eliminar células não lisadas)
filtração

Centrifugação diferencial
Precipitação seletiva
Filtração (filtros de poro conhecido)
Cromatografia (vários tipos)

Question 3

Como se faz a centrifugação diferencial?

Answer 3

Centrifugação a baixa velocidade (800 G, 10 min)
sobrenadante tem núcleos

Centrifugação a 20000 G, 15 min)
sobrenadante tem mitocôndrias e cloroplastos nas plantas

Centrifugação a (100000 G, 60 min)
sobrenadante tem plasma e membranas internas das células

Centrifugação a 1500000 G, 3h)
sobrenadante tem ribossomas

Question 4

Como se faz a precipitação seletiva?

Answer 4

As proteínas são solúveis em soluções de sais (salting in)
Para concentrações específicas apresentam baixa solubilidade e agregam-se, precipitando (salting out) por centrifugação
Sais utilizados: NaCl

Question 5

Em que consiste a cromatografia?

Answer 5

técnica de separação de moléculas baseada na distribuição diferencial dos componentes entre a fase móvel e estacionária

o objetivo é separar dois ou mais componentes de uma mistura

Question 6

Quais as cromatografias realizadas em coluna?

Answer 6

Troca iónica
afinidade
hidrofóbica
fase reversa
exclusão molecular

Question 7

Como funciona a cromatografia de troca iónica?

Answer 7

partícula na fase estacionária

uns iões ficam agarrados à fase móvel, outros não. Ficam ordenados pelo ponto isoelétrico

Question 8

Como funciona a cromatografia de afinidade?

Answer 8

matriz inerte onde se liga o ligando

ligando com afinidade para a proteína de interesse

Question 9

Como funciona a cromatografia de exclusão molecular?

Answer 9

matriz porosa (esferas)
poro com determinada dimensão
moléculas pequenas e intermédias entram no poro e demoram a sair
moléculas grandes não passam no poro mas sim à  volta e entram logo no líquido, são as primeiras a sair

Question 10

Qual a desvantagem da cromatografia de exclusão molecular?

Answer 10

não se consegue trabalhar com volumes grandes

Question 11

Quais os métodos de doseamento de proteínas?

Answer 11

diretos
espectrofotometria na uv
vantagem de não destruir proteína

indiretos colorimétricos
lowry
ácido
bradford

Question 12

Quais as características da espetrofotometria?

Answer 12

Lei Lambert Beer: soluções diluídas
Os aminoácidos aromáticos tirosina e triptofano fazem absorção a 280 nm. A fenilalanina e as pontes dissulfureto também contribuem em menor grau
Método simples e não destrutivo
As amostras devem ter um grau de pureza elevado, anéis aromáticos de ácidos nucleicos ou de alguns detergentes interferem

Question 13

Qual a desvantagem da espetrofotometria?

Answer 13

se não tivermos estes aminoácidos não funcionam

Question 14

Quais as características do método de Lowry?

Answer 14

condições alcalinas passa de púrpura para azul (ferro) quando encontra ligações peptídicas

Question 15

Quais as vantagens e desvantagens do Método de Lowry?

Answer 15

vantagem alta sensibilidade

desvantagens: tempo de reação, incompatibilidade com detergentes e agentes redutores

Question 16

Quais as características do método ácido bicinconínico?

Answer 16

duas moléculas de ácido bicinconínico reagem com cobre formando um cromóforo púrpura com um máximo absorção 562

Question 17

Quais as vantagens e desvantagens do métodos de ácido biciconinico?

Answer 17

vantagem pode se usar com agentes desnaturantes

alguna redutores interferem outros não

Question 18

Quais as características do método de Bradford?

Answer 18

O corante azul de Coomassie liga-se aos resíduos de aminoácidos. Em condições ácidas o corante fica na sua coloração vermelha com máxima absorção 470 nm. A ligação às proteínas induz conversão com coloração azul e com um máximo de absorção 595 nm

Question 19

Quais as vantagens e desvantagens do Método de Bradford?

Answer 19

É pouco preciso para proteínas de carácter acídico ou básico

Não é compatível com detergentes mas é compatível com agentes redutores

Question 20

O que é eletroforese?

Answer 20

separação de moléculas num campo elétrico pela sua massa

Question 21

Qual o gel usado na eletroforese?

Answer 21

gel de poliacrilamida descontínuo com SDS para desnaturar proteínas

Question 22

O que é a isoeletrofocagem?

Answer 22

é uma técnica de separação de diferentes moléculas tendo em conta o seu ponto isoelétrico