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Genómica > Análisis Genómicos y proteómicos > Flashcards

Análisis Genómicos y proteómicos Flashcards

1
Q

¿Qué es un recurso de muestras biológicas?

A

Colección de muestras humanas y datos asociados con fines de investigación

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2
Q

¿Qué son los métodos de investigación de bioespecimenes?

A

Los protocolos y las prácticas involucradas en la recolección, procesamiento y almacenamiento de las muestras

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3
Q

¿Cómo es el procesamiento de una muestra de sangre?

A

Por crioconservación.

Ayuda a la preservación de los linfocitos viables para la recuperación posterior del ADN.

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4
Q

¿Cómo es el procesamiento de una muestra de saliva?

A

Centrifugación de la suspensión celular

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5
Q

¿Cómo se puede hacer la extracción de DNA?

A

Con fenolcloroformo

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6
Q

Técnicas para medir la calidad y la cantidad de ADN

A

Electroforesis en gel
Absorbancia a 260 nm y 280 nm
PCR en tiempo real

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7
Q

¿Para qué sirve la extracción de RNA en medicina?

A

Para comparar los perfiles de expresión entre px sano y enfermo o también sirve para ver el impacto de un fármaco en la transcripción de manera instantánea.

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8
Q

Metodología clásica utilizada para la detección y cuantificación de mRNA presente en una célula

A

Análisis por Northern blot
rt-PCR
Hibridación

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9
Q

¿Cómo funciona un análisis por Northern blot?

A

Una sonda radioactiva en solución se une con un mRNA inmovilizado en un soporte.

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10
Q

¿En qué se basa la hibridación?

A

En la complementariedad de las bases pero tiene una debilidad: la detección

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11
Q

¿Qué requiere la detección de emisión de radioactividad?

A

Autorradiografía y el escaneo con detectores de radiaciones B y que aumentan hasta 100 veces la sensibilidad de la técnica de hibridación.

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12
Q

Etimología de microarray

A

[griego] mikro (pequeño) y [inglés] array (distribución ordenada).

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13
Q

Función de los microarrays

A

Permiten el depósito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su estudio en paralelo

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14
Q

Técnicas que combinan los estudios de microarrays?

A

Hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia.

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15
Q

Concepto básico en microarrays

A

Posicionamiento preciso en un soporte sólido de elementos que funcionen como detectores moleculares en altas densidades

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16
Q

Target y sonda de los microarrays

A

El target es la parte móvil y las sondas son fijas en el microchip.

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17
Q

Microarray de ácido nucleicos

A

Los amplicones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por capilaridad en portaobjetos de vidrio mediante robots que requieren un ambiente libre de partículas.

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18
Q

Sondas en los microarray de ácido nucleicos

A

Son producidas en laboratorios mediante amplificación selectiva de cDNAS [100-3000 Nucleotidos] por PCR en placas de 96 pocillos

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19
Q

Microarrays de Oligonucleótidos

A

Los fragmentos pueden ser presintetizados y depositados en portaobjetos por robots o sintetizadas in situ y depositados por ink jet o fotolitografía.

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20
Q

Sondas en microarrays de oligonucleótidos

A

Son porciones de DNA sintético de cadena simple que pueden ser cortas (15-20 nucleótidos) o largas (50-120 nucleótidos)

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21
Q

Limitantes en los microarrays de proteínas

A

Requiere de tiempo para esclarecerse, existe la dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3D y detectar interacciones de proteínas plegadas y aún no se dispone de colorantes fluorescentes que permitan cuantificar eficientemente las moléculas.

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22
Q

Sondas de los microarrays de tejidos

A

Muestras mm del tejido embebido en parafina. Se depositan en un nuevo bloque de parafina y se cortan con un microtomo entre 100-500 veces, se reordenan sobre portaobjetos de vidrio donde se realizarán pruebas múltiples a nivel DNA,RNA y proteínas

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23
Q

Pasos en los microarrays con 2 colorantes

A

 Generación de los microarrays
 Marcación RNA (Hibridación)
 Lectura con 2 canales
 Composición de imágenes (Focos amarillos positivos y apagados negativos con mucha especificidad)

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24
Q

Pasos básicos de una PCR

A

Desnaturalización de DNA en cada ciclo a 90°C para que se abran las hebras, disminución de temperatura a 45° para poner el primer y que se una al templado (hibridación) y a 72° es la temperatura de elongación o amplificación

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25
Q

Cuantificación de la secuencia amplificada en PCR tradicional

A

Se realizan al final de la reacción después del último ciclo de PCR, e involucran análisis post-PCR como electroforesis en gel y análisis de imagen.

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26
Q

Cuantificación de la secuencia amplificada en PCR en tiempo real

A

El producto de la PCR se mide en cada ciclo. Más precisión

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27
Q

¿Cómo se mide la cantidad de ADN después de cada ciclo?

A

Mediante tintes fluorescentes que producen una señal fluorescente creciente en proporción directa al número de moléculas de producto de PCR (amplicones) generadas.

28
Q

Reporteros fluorescentes utilizados en la rtPCR

A

ADN de doble cadena (dsADN) - colorantes de unión, o moléculas de colorante unidas a cebadores de PCR o sondas que se hibridan con productos de la PCR durante la amplificación.

29
Q

Ventajas de la PCR tiempo real

A
  • Capacidad para monitorear el progreso de las reacciones de PCR individuales a medida que ocurren en tiempo real
  • Capacidad para medir con precisión la cantidad de ampliación en cada ciclo
  • Un mayor rango dinámico de detección.
  • La amplificación y detección se producen en un solo tubo, lo que elimina las manipulaciones posteriores.
30
Q

Pasos de PCR en tiempo real

A
  1. Desnaturalización
  2. Anneling
  3. Extensión
31
Q

¿Qué ocurre durante la desnaturalización?

A

Incubación a alta temperatura (95°) para fundir el dsDNA en cadenas simples y aflojar la estructura secundaria en el DNA de cadena simple (ssDNA).

32
Q

¿Qué ocurre durante Anneling?

A

Las secuencias complementarias tienen la oportunidad de hibridarse, usando la temperatura de fusión calculada de los cebadores (5° por debajo del Tm del cebador)

33
Q

¿Qué ocurre durante Extensión?

A

A 70-72° la actividad de la ADN polimerasa es óptima y la extensión del cebador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo.

34
Q

Longitud de los primers en el diseño de rtPCR

A

Entre 18-24 nucleótidos de longitud.

35
Q

Características de los diseños de primers de rtPCR

A
  • Temperaturas de fusión compatibles (1°) de cebadores y 50% de contenido de GC.
  • Cebadores con alto contenido de GC forman híbridos imperfectos estables.
  • Alto contenido de AT deprime a Tm de los híbridos perfectamente combinados.
  • El extremo 3’ del cebador rico en GC para mejorar la hibridación del extremo que se extenderá.
36
Q

¿Qué ocurre en TaqMan?

A

Durante la PCR, los primers y la sonda se hibridan al DNA blanco. La ADN polimerasa extiende el cebador corriente arriba de la sonda.
Si la sonda está unida a la secuencia objetivo-correcta, se enciende la sonda y libera un fragmento que contiene el colorante indicador.

37
Q

Fenómeno de FRET

A

Cada que se alejan floroforos se aumenta fluorecencia.

38
Q

¿Qué es SYBR Green?

A

Un fluoróforo de unión al ADN que se une al surco menor de cualquier dsADN.

39
Q

¿Qué efecto tiene la excitación del SYBR Green unido a ADN?

A

Produce una señal fluorescente mucho más fuerte que el colorante no unido.
En condiciones ideales, sigue un patrón de amplificación similar al de un ensayo basado en sonda TaqMan.

40
Q

Aspectos importantes para entender la función de las proteínas:

A 
	Secuencia y estructura de proteínas
	Historial evolutivo y secuencias conservadas
	Perfil de expresión
	Modificaciones postraduccionales
	Interacciones con otras proteínas
	Localización intracelular
41
Q

Función de la secuencia y estructura de proteínas

A

Se utilizan para descubrir motivos que predicen la función de las proteínas

42
Q

Función del historial evolutivo y secuencias conservadas de las proteínas

A

Identifica residuos reguladores clave

43
Q

Función de las modificaciones post traduccionales de las proteínas

A

La fosforilación, acilación, glicosilación y ubiquitinación sugieren localización, activación y / o función. Agregan variabilidad a las proteínas

44
Q

Función del perfil de expresión de proteínas

A

Revela la especificidad del tipo de célula y cómo se regula la expresión

45
Q

Función de la localización intracelular de las proteínas

A

Puede aludir a la función de la proteína.

46
Q

¿Cuáles son las interacciones estables de proteínas?

A

Son aquellas asociadas con proteínas que se purifican como complejos de múltiples subunidades, y las subunidades de estos complejos pueden ser idénticas o diferentes.

47
Q

Ejemplos de interacciones estables

A

Hemoglobina

ARN polimerasa central

48
Q

Efectos biológicos de las interacciones proteína-proteína

A

 Alterar las propiedades cinéticas de las enzimas
 Canalización de sustratos moviendo un sustrato entre dominios
 Crear un nuevo sitio de unión, para moléculas efectoras pequeñas
 Inactivar o destruir una proteína.
 Cambiar la especificidad de una proteína

49
Q

Métodos para analizar interacciones estables de proteínas

A

Co-inmunoprecipitación

Pull-down assay

50
Q

Métodos para analizar interacciones transitorias de proteínas

A

Entrecruzamiento de proteínas

Etiquetado de proteínas de transferencia

51
Q

Tipos de interacciones proteína-proteína

A

Estables o transitorias

-Fuertes o débiles

52
Q

Métodos para analizar interacciones moderadamente estables de proteínas

A

Far Western blot

53
Q

¿Cómo funciona la co-inmunopecipitación?

A

Utiliza anticuerpos para capturar complejos de proteínas

54
Q

¿Cómo funcionan los ensayos pull-down?

A

Utilizan una proteína “cebo” para purificar cualquier proteína en un lisado que se une al cebo.

55
Q

Resultado de los ensayos pull-down

A

Se libera el anticuerpo con la proteína presa: obteniendo 2 bandas si existe la interacción.
-Siempre que en la muestra se encuentre la proteína blanco -> Hay interacción

56
Q

¿Cómo son la mayoría de las interacciones proteína-proteína?

A

Transitorias y ocurren solo brevemente como parte de una cascada u otra función metabólica dentro de las células.

57
Q

¿Para qué sirve el análisis de interacción por crosslinking de proteínas?

A

Para estabilizar o unir permanentemente los componentes de los complejos de interacción

58
Q

Tipo de enlace en el crosslinking de proteínas

A

Covalente

59
Q

¿Cómo funciona el análisis far-western blot?

A

Las interacciones se detectan mediante incubación por electroforesis de proteínas con una proteína de cebo etiquetada y purificada

60
Q

Pasos de la electroforesis vertical

A
  1. Preparación del gel
  2. Montaje de la cubeta
  3. Aplicación de la muestra
  4. Electroforesis
  5. Detección por tinción: Azul de Coomassie
61
Q

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR / FILTRACIÓN EN GEL

A

Separa proteínas por su tamaño, matriz llena de poros que permite el paso de proteínas con moléculas muy pequeñas, las más grandes no pueden pasar por ahí y salen directamente por las columnas (sin pasar por laberinto)

62
Q

CROMATOGRAFÍA POR INTERACCIONES HIDROFÓBICAS

A

Entre más hidrofóbica sea una proteína estará más unida a la matriz

63
Q

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

A

En matriz hay cargas positivas que interacciones con proteínas negativas o viceversa, entre más fuerte sea la carga de una proteína mayor s unión con la matriz

64
Q

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

A

Un cuerpo se une a la matriz que se une con la presa

65
Q

CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA

A

Diferentes sustancias modifican la polaridad del medio y también por su hidrofobisidad.

66
Q

ESPECTROMETRÍA DE MASAS ASOCIADA A TOF

A

Vaporiza proteínas con un láser y atraviesan un campo magnético que separa por cargas, haciendo proyecciones a un detector y dependiendo del tamaño y composición será su tiempo de vuelo

Genómica (8 decks)

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