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Análisis Genómicos y proteómicos Flashcards

1
Q

¿Qué es un recurso de muestras biológicas?

A

Colección de muestras humanas y datos asociados con fines de investigación

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2
Q

¿Qué son los métodos de investigación de bioespecimenes?

A

Los protocolos y las prácticas involucradas en la recolección, procesamiento y almacenamiento de las muestras

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3
Q

¿Cómo es el procesamiento de una muestra de sangre?

A

Por crioconservación.

Ayuda a la preservación de los linfocitos viables para la recuperación posterior del ADN.

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4
Q

¿Cómo es el procesamiento de una muestra de saliva?

A

Centrifugación de la suspensión celular

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5
Q

¿Cómo se puede hacer la extracción de DNA?

A

Con fenolcloroformo

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6
Q

Técnicas para medir la calidad y la cantidad de ADN

A

Electroforesis en gel
Absorbancia a 260 nm y 280 nm
PCR en tiempo real

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7
Q

¿Para qué sirve la extracción de RNA en medicina?

A

Para comparar los perfiles de expresión entre px sano y enfermo o también sirve para ver el impacto de un fármaco en la transcripción de manera instantánea.

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8
Q

Metodología clásica utilizada para la detección y cuantificación de mRNA presente en una célula

A

Análisis por Northern blot
rt-PCR
Hibridación

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9
Q

¿Cómo funciona un análisis por Northern blot?

A

Una sonda radioactiva en solución se une con un mRNA inmovilizado en un soporte.

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10
Q

¿En qué se basa la hibridación?

A

En la complementariedad de las bases pero tiene una debilidad: la detección

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11
Q

¿Qué requiere la detección de emisión de radioactividad?

A

Autorradiografía y el escaneo con detectores de radiaciones B y que aumentan hasta 100 veces la sensibilidad de la técnica de hibridación.

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12
Q

Etimología de microarray

A

[griego] mikro (pequeño) y [inglés] array (distribución ordenada).

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13
Q

Función de los microarrays

A

Permiten el depósito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su estudio en paralelo

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14
Q

Técnicas que combinan los estudios de microarrays?

A

Hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia.

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15
Q

Concepto básico en microarrays

A

Posicionamiento preciso en un soporte sólido de elementos que funcionen como detectores moleculares en altas densidades

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16
Q

Target y sonda de los microarrays

A

El target es la parte móvil y las sondas son fijas en el microchip.

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17
Q

Microarray de ácido nucleicos

A

Los amplicones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por capilaridad en portaobjetos de vidrio mediante robots que requieren un ambiente libre de partículas.

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18
Q

Sondas en los microarray de ácido nucleicos

A

Son producidas en laboratorios mediante amplificación selectiva de cDNAS [100-3000 Nucleotidos] por PCR en placas de 96 pocillos

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19
Q

Microarrays de Oligonucleótidos

A

Los fragmentos pueden ser presintetizados y depositados en portaobjetos por robots o sintetizadas in situ y depositados por ink jet o fotolitografía.

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20
Q

Sondas en microarrays de oligonucleótidos

A

Son porciones de DNA sintético de cadena simple que pueden ser cortas (15-20 nucleótidos) o largas (50-120 nucleótidos)

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21
Q

Limitantes en los microarrays de proteínas

A

Requiere de tiempo para esclarecerse, existe la dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3D y detectar interacciones de proteínas plegadas y aún no se dispone de colorantes fluorescentes que permitan cuantificar eficientemente las moléculas.

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22
Q

Sondas de los microarrays de tejidos

A

Muestras mm del tejido embebido en parafina. Se depositan en un nuevo bloque de parafina y se cortan con un microtomo entre 100-500 veces, se reordenan sobre portaobjetos de vidrio donde se realizarán pruebas múltiples a nivel DNA,RNA y proteínas

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23
Q

Pasos en los microarrays con 2 colorantes

A

 Generación de los microarrays
 Marcación RNA (Hibridación)
 Lectura con 2 canales
 Composición de imágenes (Focos amarillos positivos y apagados negativos con mucha especificidad)

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24
Q

Pasos básicos de una PCR

A

Desnaturalización de DNA en cada ciclo a 90°C para que se abran las hebras, disminución de temperatura a 45° para poner el primer y que se una al templado (hibridación) y a 72° es la temperatura de elongación o amplificación

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25
Cuantificación de la secuencia amplificada en PCR tradicional
Se realizan al final de la reacción después del último ciclo de PCR, e involucran análisis post-PCR como electroforesis en gel y análisis de imagen.
26
Cuantificación de la secuencia amplificada en PCR en tiempo real
El producto de la PCR se mide en cada ciclo. Más precisión
27
¿Cómo se mide la cantidad de ADN después de cada ciclo?
Mediante tintes fluorescentes que producen una señal fluorescente creciente en proporción directa al número de moléculas de producto de PCR (amplicones) generadas.
28
Reporteros fluorescentes utilizados en la rtPCR
ADN de doble cadena (dsADN) - colorantes de unión, o moléculas de colorante unidas a cebadores de PCR o sondas que se hibridan con productos de la PCR durante la amplificación.
29
Ventajas de la PCR tiempo real
* Capacidad para monitorear el progreso de las reacciones de PCR individuales a medida que ocurren en tiempo real * Capacidad para medir con precisión la cantidad de ampliación en cada ciclo * Un mayor rango dinámico de detección. * La amplificación y detección se producen en un solo tubo, lo que elimina las manipulaciones posteriores.
30
Pasos de PCR en tiempo real
1. Desnaturalización 2. Anneling 3. Extensión
31
¿Qué ocurre durante la desnaturalización?
Incubación a alta temperatura (95°) para fundir el dsDNA en cadenas simples y aflojar la estructura secundaria en el DNA de cadena simple (ssDNA).
32
¿Qué ocurre durante Anneling?
Las secuencias complementarias tienen la oportunidad de hibridarse, usando la temperatura de fusión calculada de los cebadores (5° por debajo del Tm del cebador)
33
¿Qué ocurre durante Extensión?
A 70-72° la actividad de la ADN polimerasa es óptima y la extensión del cebador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo.
34
Longitud de los primers en el diseño de rtPCR
Entre 18-24 nucleótidos de longitud.
35
Características de los diseños de primers de rtPCR
- Temperaturas de fusión compatibles (1°) de cebadores y 50% de contenido de GC. - Cebadores con alto contenido de GC forman híbridos imperfectos estables. - Alto contenido de AT deprime a Tm de los híbridos perfectamente combinados. - El extremo 3’ del cebador rico en GC para mejorar la hibridación del extremo que se extenderá.
36
¿Qué ocurre en TaqMan?
Durante la PCR, los primers y la sonda se hibridan al DNA blanco. La ADN polimerasa extiende el cebador corriente arriba de la sonda. Si la sonda está unida a la secuencia objetivo-correcta, se enciende la sonda y libera un fragmento que contiene el colorante indicador.
37
Fenómeno de FRET
Cada que se alejan floroforos se aumenta fluorecencia.
38
¿Qué es SYBR Green?
Un fluoróforo de unión al ADN que se une al surco menor de cualquier dsADN.
39
¿Qué efecto tiene la excitación del SYBR Green unido a ADN?
Produce una señal fluorescente mucho más fuerte que el colorante no unido. En condiciones ideales, sigue un patrón de amplificación similar al de un ensayo basado en sonda TaqMan.
40
Aspectos importantes para entender la función de las proteínas:
```  Secuencia y estructura de proteínas  Historial evolutivo y secuencias conservadas  Perfil de expresión  Modificaciones postraduccionales  Interacciones con otras proteínas  Localización intracelular ```
41
Función de la secuencia y estructura de proteínas
Se utilizan para descubrir motivos que predicen la función de las proteínas
42
Función del historial evolutivo y secuencias conservadas de las proteínas
Identifica residuos reguladores clave
43
Función de las modificaciones post traduccionales de las proteínas
La fosforilación, acilación, glicosilación y ubiquitinación sugieren localización, activación y / o función. Agregan variabilidad a las proteínas
44
Función del perfil de expresión de proteínas
Revela la especificidad del tipo de célula y cómo se regula la expresión
45
Función de la localización intracelular de las proteínas
Puede aludir a la función de la proteína.
46
¿Cuáles son las interacciones estables de proteínas?
Son aquellas asociadas con proteínas que se purifican como complejos de múltiples subunidades, y las subunidades de estos complejos pueden ser idénticas o diferentes.
47
Ejemplos de interacciones estables
Hemoglobina | ARN polimerasa central
48
Efectos biológicos de las interacciones proteína-proteína
 Alterar las propiedades cinéticas de las enzimas  Canalización de sustratos moviendo un sustrato entre dominios  Crear un nuevo sitio de unión, para moléculas efectoras pequeñas  Inactivar o destruir una proteína.  Cambiar la especificidad de una proteína
49
Métodos para analizar interacciones estables de proteínas
Co-inmunoprecipitación | Pull-down assay
50
Métodos para analizar interacciones transitorias de proteínas
Entrecruzamiento de proteínas | Etiquetado de proteínas de transferencia
51
Tipos de interacciones proteína-proteína
Estables o transitorias | -Fuertes o débiles
52
Métodos para analizar interacciones moderadamente estables de proteínas
Far Western blot
53
¿Cómo funciona la co-inmunopecipitación?
Utiliza anticuerpos para capturar complejos de proteínas
54
¿Cómo funcionan los ensayos pull-down?
Utilizan una proteína "cebo" para purificar cualquier proteína en un lisado que se une al cebo.
55
Resultado de los ensayos pull-down
Se libera el anticuerpo con la proteína presa: obteniendo 2 bandas si existe la interacción. -Siempre que en la muestra se encuentre la proteína blanco -> Hay interacción
56
¿Cómo son la mayoría de las interacciones proteína-proteína?
Transitorias y ocurren solo brevemente como parte de una cascada u otra función metabólica dentro de las células.
57
¿Para qué sirve el análisis de interacción por crosslinking de proteínas?
Para estabilizar o unir permanentemente los componentes de los complejos de interacción
58
Tipo de enlace en el crosslinking de proteínas
Covalente
59
¿Cómo funciona el análisis far-western blot?
Las interacciones se detectan mediante incubación por electroforesis de proteínas con una proteína de cebo etiquetada y purificada
60
Pasos de la electroforesis vertical
1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie
61
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR / FILTRACIÓN EN GEL
Separa proteínas por su tamaño, matriz llena de poros que permite el paso de proteínas con moléculas muy pequeñas, las más grandes no pueden pasar por ahí y salen directamente por las columnas (sin pasar por laberinto)
62
CROMATOGRAFÍA POR INTERACCIONES HIDROFÓBICAS
Entre más hidrofóbica sea una proteína estará más unida a la matriz
63
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO
En matriz hay cargas positivas que interacciones con proteínas negativas o viceversa, entre más fuerte sea la carga de una proteína mayor s unión con la matriz
64
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Un cuerpo se une a la matriz que se une con la presa
65
CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA
Diferentes sustancias modifican la polaridad del medio y también por su hidrofobisidad.
66
ESPECTROMETRÍA DE MASAS ASOCIADA A TOF
Vaporiza proteínas con un láser y atraviesan un campo magnético que separa por cargas, haciendo proyecciones a un detector y dependiendo del tamaño y composición será su tiempo de vuelo

Genómica (8 decks)

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