Analisis genomicos proteicos: Parte 2 (PCR)

Question 1

Cual es la principal funcion de la PCR?

Answer 1

Amplificar secuencias especificas de DNA o cDNA, usando oligonucleotidos, una DNA polimerasa termoestable y ciclos termicos

Question 2

Cuales son las caracteristicas de la PCR punto final (tradicional)?

Answer 2

Deteccion y cauntificacion de la secuencia amplificada hasta el final de la PCR
Usa analisis Post-PCR:
- Electroforesis
- Analisis de imagen

Question 3

Cuales son las caracteristicas de la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)?

Answer 3

Medicion del producto al final de cada ciclo mediante fluorescencia
La fluorescencia es en proporcion directa al numero de productos por ciclo generados
Determinar la cantidad inicial del objetivo
Los fluoresecnetes son:
- dsDNA
- Colorantes de union
- Moleculas colorante unidas a cebadores

Question 4

Cuales son las ventajas de la PCR tiempo real?

Answer 4

• Monitorear el progreso de las reacciones de la PCR
• Medir la cantidad de amplicones creados por ciclo
• Mayor rango dinamico de deteccion
• Eliminacion de manipulaciones posteriores a la PCR
• Principal herramienta para deteccion y cuantificacion de DNA o RNA

Question 5

Cuales son los componentes esenciales para la PCR?

Answer 5

Taq-polimerasa DNA
dNTP’s
Magnesio
Diseño de primers

Question 6

Cuales son las 2 sondas fluorescentes de la PCR fluorescente? y cual es su principal caracteristica?

Answer 6

TaqMan
SYBR Green
Principal caracteristica:
- **Son ensayos de nucleasa 5’

Question 7

Cuales son las caracteristicas de TaqMan?

Answer 7

El dominio nucleasa 5’ degrada DNA templado corriente abajo
Uso de FRET (transferencia de energía de resonancia de fuorescencia)
Quencher inhibe la fluoresencia de FRET

Question 8

Explica como funciona TaqMan

Answer 8

1. • En PCR, los primers y sonda se hibridan al DNA blanco
2. • La nucleasa 5’ escinde la sonda y libera un fragmento con el colorante
3. • La molecula reportera liberada ya no se apaga

Question 9

Cuales son las caracteristicas de SYBR Green?

Answer 9

• Es un fluoruro de union al surco menor del dsDNA, produce una señal fluorescente
• Usa 2 primers
• Si la muestra esta presente en la PCR se observa una linea horizontal
• Tambien generara suficiente producto para que sea visible una señal de amplificacion

Question 10

Cuales son las desventajas de SYBR Green?

Answer 10

Poco especifica en comparacion con TaqMan

Se une a cualquier producto amplificado (sea target o no target)