Análisis genómicos Flashcards
De acuerdo al Instituto Nacional de Cáncer de EE.UU., ¿qué es un recurso de muestras biológicas?
Colección de muestras humanas y datos asociados con fines de investigación, la entidad física donde se almacena la colección y todos los procesos y políticas relevantes.
¿Qué comprende la “ciencia de la bioespecimen”?
Protocolos y prácticas involucradas en la recolección, procesamiento y almacenamiento de las muestras.
¿Con qué fin se recolectan las muestras biológicas?
Para el control y cuidado normal del paciente, estudios de investigación básica, clínica y epidemiológica.
¿Qué cosas se deben saber antes de la recolección de las muestras?
- Objetivos del estudio.
- Si otros análisis de laboratorio se beneficiarán con esa recolección.
- Qué tipo de muestra biológica se requiere.
- Cuántos especímenes se recogerán.
- Qué cantidad se requiere de muestra por cada espécimen.
- Si se debe de almacenar en alícuotas más pequeñas para no descongelar a una más grande.
- Si las muestras se almacenarán desde antes del análisis.
- Si las muestras deben de trasladarse para su análisis.
- Si ya se sabe que recipientes de almacenamiento usar, etiquetar y codificar.
- Qué datos se recopilarán del estudio y si una computadora o sistema puede hacerlo.
- Tener consentimiento informado apropiado, la privacidad, regulaciones éticas y legales están establecidas adecuadamente.
- Si los fondos son suficientes para hacer el estudio.
¿Qué sistema se usa para la recolección de sangre?
Becton-Dickenson Vacutainer.
¿Cuál es el mejor enfoque para el manejo de unamuestra?
Recolectar, estabilizar (congelar o fijar) y procesarlas lo más rápido posible.
Ventajas de la recolección de saliva / células bucales.
- Es más barato.
- Gran fuente de ADN.
- Los px lo prefieren antes que la toma de sangre.
¿Cómo se separa la sangre para sus diferentes análisis?
En fracciones:
- Plasma.
- Capa leucocitaria.
- Glóbulos rojos.
¿Qué hace la crioconservación?
Preservar los linfocitos viables para la recuperación posterior del ADN o para que el virus de Epstein-Barr cree líneas celulares linfoblastoides como fuente de cantidades limitadas de ADN.
¿Qué crioprotector se usa en la crioconservación?
Dimetilsulfóxido.
¿Cómo es el procesamiento de células bucales a partir del protocolo de enjuague bucal?
Mediante centrifugación de la suspensión celular, resuspensión en un tampón, y se procesan inmediatamente o se congelan para uso futuro.
*Se puede extraer el ADN, aunque estas muestras incluyen mucho ADN bacteriano y se recomienda PCR en tiempo real.
¿Cómo es la extracción de DNA?
Se considera la extracción con fenolcloroformo.
Se usa PCR en tiempo real, y para medir la calidad y cantidad de ADN las técnicas verían desde la absorbancia de 260-280 nm o fluorescencia.
¿Qué indica la relación A260 / A280?
Es una medida aproximada de la pureza del DNA y la contaminación de proteínas.
V / F : El ARN es más estable que el ADN y es más fácil de extraerlo intacto.
FALSO; el ARN es menos estable y más dificil de extraerlo intacto.
¿Qué métodos se usan para la cuantificación de mRNA en una célula?
El análisis por Northern blot y RT-PCR.
¿En qué consiste el análisis por Northern blot?
Una sonda radioactiva en solución se une con un mRNA inmovilizado en un soporte.
¿En qué consiste el análisis por RT-PCR?
El mRNA se copia a cDNA y se genera un intermediario de doble cadena por la relación de transcripción reversa y posterior amplificación de la cadena por la reacción de la polimerasa.
¿Qué son los microarrays?
El posicionamiento preciso en un soporte sólido de elementos que funcionen como detectores moleculares en altas densidades.
¿Qué permiten los microarreglos / micromatrices?
El depósito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su estudio paralelo; y por eso es posible tener una visión instantánea de actividad de genomas completos o de un grupo selecto de genes.
Fundamento de la función de los estudios de microarrays.
Se combinan las técnicas de hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia.
*Sólo donde haya hibridización, habrá fluorescencia, y su intensidad será proporcional al nivel de expresión del gen en estudio.
Condición indispensable para el diseño de los microarrays.
Que cada porción inmovilizada del gen lleve si cédula de identidad para que sea fácilmente distinguible de otros.
¿Cómo es el proceso de los microarrays de ácidos nucleicos / cDNA?
Sondas = se producen en laboratorios por la amplificación selectiva de cDNAs (100-3000 nucleotidos), por PCR en placas de 96 pocillos.
Las amplificaciones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por capilaridad en portaobjetos de vidrio.
¿Cómo es el proceso de los microarrays de oligonucleótidos?
Sondas = porciones de DNA sintético de cadena simple; cortas (15-25 nucleótidos) o largas (50-120 nucleótidos).
Pueden ser presintetizados y depositados en portaobjetos por robots, o sintetizados in situ y depositados por ink jet o fotolitografía (DNA chips).
¿Cómo es el proceso de los microarrays de proteínas?
Sondas = anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio.
Blancos = suero o tejido.
Está restringida por la dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3D y detectar interacciones de proteína plegadas, y además no hay colorantes fluorescentes para cuantificar a estas moléculas.
¿Cómo es el proceso de los microarrays de tejidos?
Con una aguja hueca se toman muestras milimétricas de los tejidos en parafina. Luego se depositan en un nuevo bloque de parafina y se cortan 100-500 veces y se ponen en un portaobjetos.
¿Qué pasa en la PCR tradicional?
La detección y cuantificación de la secuencia amplificada se realizan al final de la reacción, después del último ciclo de PCR; se usa también electroforesis en gel y análisis de imagen.
¿Qué pasa en la PCR cuantitativa en tiempo real?
El producto de la PCR se mide en cada ciclo mediante fluorescencia, esto permite determinar la cantidad inicial del objetivo con gran precisión.
¿Cómo funcionan las PCR?
Amplifican el ADN exponencialmente, duplicando el número de moléculas diana con cada ciclo de amplificación.
Ventajas de la PCR en tiempo real:
- Capacidad para monitorear el progreso de las reacciones de PCR individuales a medida que ocurren en tiempo real.
- Capacidad para medir con precisión la cantidad de amplicón en cada ciclo = cuantificación precisa de la cantidad de material.
- Mayor rango dinámico de detección.
- La amplificación y detección se producen en un solo tubo, lo que elimina las manipulaciones posteriores a la PCR.
Pasos de PCR en tiempo real:
- Desnaturalización: alta temperatura para “fundir” el dsDNA en cadenas simples.
- Anneling: las secuencias complementarias pueden hibridarse.
- Extensión: optima actividad de la ADN polimerasa (70-72ºC), la extensión del cebador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo.
¿Cuáles son los parámetros de la PCR en tiempo real?
- ADN polimerasa.
- dNTPs.
- Concentración de magnesio.
- Buena técnica experimental.
- Diseño de primers de PCR en tiempo real.
¿Qué es la baseline de la RT-PCR?
Es el nivel de señal durante los ciclos iniciales de la PCR.
¿Qué es el threshold (límite) de la RT-PCR?
El umbral de la reacción es el nivel de señal que refleja un aumento estadísticamente significativo sobre la señal de la línea base calculada.
¿Para qué sirve la curva estándar?
Para derivar información sobre el desempeño de la reacción, así como varios parámetros de reacción.
