8- Technologies de l'ADN

Question 1

Que sont les enzymes de restriction

Answer 1

Endonucléases coupant l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences spécifiques, dites sites de restriction. Majoritairement des séquences palindromiques

Question 2

Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction

Answer 2

Défense contre les virus des bactéries (bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux

Question 3

Que peut former la coupure par des enzymes de restriction

Answer 3

Bouts collants (le lien phosphodiester coupé n’est pas au milieu du site de restriction) ou francs

Question 4

Comment peut-on séparer et identifier les fragments d’ADN coupés après la digestion avec des enzymes de restriction

Answer 4

Séparés selon la taille parélectrophorèse sur gel d’Agarose

Question 5

Comment migre l’ADN suite à l’application du champ électrique dans le gel d’Agarose

Answer 5

Vers le pôle +, car l’ADN est -
Plus petit ira plus vite, donc + loin

Question 6

Comment se fait la détection des fragments d’ADN dans un gel

Answer 6

Bromure d’éthidium, un agent intercalant (cancérigène) qui est une molécule fluorescente s’intercalant dans la double hélice, et rayons UV
OU
ADN marqué radioactivement (p32)

Question 7

Comment joindre les bout coupés par une enzyme de restriction

Answer 7

Ligase

Question 8

Qu’est-ce que la ligation

Answer 8

Joindre 2 bouts d’ADN
Création d’ADN recombinant au labo en rejoignant n’importe quels fragments d’ADN avec une ligase
Marche pour les bouts collants et francs (efficacité 100x plus faible)

Question 9

Qu’est-ce que le cloning

Answer 9

Ligation d’un fragment d’ADN dans un vecteur qui se réplique de façon autonome comme un plasmide

Question 10

C’est quoi un plasmide

Answer 10

Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de manière autonome dans un organisme hôte
Il a une origine de réplication fonctionnelle et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication

Question 11

que contient le plasmide utilisé comme vecteur

Answer 11

Origine de réplication
Gène de sélection (résistance à des antibios) pour sélectionner bactéries contenant le vecteur
Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragemtns d’ADN
Site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN)

Question 12

Qu’est-ce qu’une transformation

Answer 12

Insérer un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Efficacité de 1/2000, sélectionne cellules ayant le plasmide grâce à l’antibio

Question 13

Quelles sont les utilisations possibles de l’ADN amplifié

Answer 13

Préparer une grande qté d’insert afin de le séquencer
Poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
Production de protéines recombinantes (insuline humaine, GH humaine), facetris de coagulation, immunogènes pour vaccins, lactase, etc

Question 14

Qu’est-ce que GFP

Answer 14

Protéine flurorescente de méduse
Fusions de gènes avec GFP permettent d’étudier in vivo:
niveaux de transcription des gènes
niveaux de traduction
Localisation cellulaire de protéines
co-localisation cellulaire

Question 15

Que permettent les protéines fluorescentes de différentes couleurss

Answer 15

Co-localisation de protéines et de structures cellulaires

Question 16

Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro?

Answer 16

ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
Dépent d’une matrice - obtenu de la dénaturation thermique d’ADN
Besoin d’amorce - Oligonucléotides ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation

Question 17

Que se passe-t’il à l’ADN avec la hausse de la température

Answer 17

Passe de double à simple brin et l’absorbance monte
Même effet observé avec hausse de pH
Point d”inflexion=Tm

Question 18

Que se passe-t’il pour la dénaturation d’un ADN poly A-T vs G-C

Answer 18

Poly G-C a besoin de plus d’énergie, car 3 ponts-H au lieu de 2, donc T plus haute requise
ADN WT entre les 2

Question 19

Qu’est-ce que l’hybridation

Answer 19

L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (hybridation) en ADN double brin lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)

Question 20

quelle est la méthode de Sanger

Answer 20

Aussi appelée didéoxy
Moyen pour détecter une mutation dans un gène par exemple
On ajoute quelques didéoxyribonucléotides (ddNTP) qui ont un H au lieu de OH au bout 3’, ce qui arrête la réaction de polymérisation
1. Séparation des brins et ajout d’amorce
2. Ajout des amorces, dG, dA, dT, et dC, un des dNTP est marqué pour détection. Ajout d’un des ddNTP par tube et ADN polymérase
3. Séparation sur gel des fragements et détection des brins synthétisés par extension de l’amorce
4. Lecture de la séquence sur gel

Question 21

Comment est l’amorce dans la méthode du didéoxy

Answer 21

15 à 30 nucléotides, c’est un oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice l’amorce est radioactive ou fluorescente. Pol permet ajoutdes dNTP et polymérise en 3’ de l’amorce

Question 22

Comment se fait un cycle de PCR

Answer 22

Réaction de polymérisation en chaîne
1. Séparation des brins (95°)
2. Hybridation des amorces (55°)
3. Synthèse par la Taq1 ADN polymérase (72°)

Question 23

Comment se fait l’amplification par PCR

Answer 23

20-30 cycles de 5 minutes
Taq pol extraite d’une bactérie thermophile

Question 24

Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30 cycles?

Answer 24

10 = 1024
20 = 1 048 576
30 = 1 073 741 842

Question 25

Quelle est l’utilisation du PCR en médecine légale

Answer 25

STR et VNTR
Copies d’ADN du père et de la mère sont analysées. Si les deux copies du VNTR/STR n’ont pas le même nombre de séquences répétées on voit deux bandes après le gel d’électrophorèse
Plus le STR ou VNTR testé est polymorphique (nombre de séquences répétées très variable selon les individus), plus il est utile dans ce test de profil génétique
Permet de déterminer qui est le vrai père ou la vraie mère p/e

Question 26

Que sont les SNP

Answer 26

Polymorphisme de nucléotide simple
Représentent 90% des variations génétiques humaines

Question 27

Comment est l’ADN de 2 personnes prisent au hasard

Answer 27

99,9% identique
Restant sont des variations qui caractérisent chaque individu
Variations, cependant, peuvent fortement affecter le risque de maladie
Sites de séquence d’ADN ou les indivius diffèrent selon une seule base d’ADN=polymorphismes de nucléotides simples

Question 28

Quantité de SNP

Answer 28

1/300 nucléotides
Environ 10 millions au total
Créent un motif d’ADN unique pour cette personne

Question 29

Différence entre SNP et mutation

Answer 29

SNP: variation de base d’ADN simple trouvée dans + de 1% de la population (donc une variante dans la pop et pas un cas aléatoire)
Mutation: variation de base d’ADN simple trouvée dans - de 1% de la population

Question 30

SNP sont liés à quoi

Answer 30

Traits génétiques comme la couleur des yeux, cheveux, performance musculaire, comportement social, hérédité et susceptibilité à des maladies, réponse individuelle à des médicaments

Question 31

Que peuvent faire les SNP pour la santé

Answer 31

Déterminer les probabilité d’avoir un cancer (femmes ayant un variant dans le gène BRCA-1 sont 7x plus susceptibles d’êtres atteintes du cancer du sein), fibrose kystique (si on manque CTT si on est homozygote pour cet allèle), …

Question 32

Types de SNP

Answer 32

Causatifs: causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, différence de réponse à un traitement
Liés: à proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement. Ne causent pas des traits mais servent de marqueurs
Des régions codantes: peuvent affecter la séquence et fonction des protéines
Des régions non-codantes: peuvent affecter l’épissage du pré-ARNm, la régulation d’un gène, niveau d’expression

Question 33

But du projet HapMap

Answer 33

Réduire le nombre de SNP requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype
réduire de 10 millions de SNR à 500 000 SNP étiquettes
Permet des études du génome beaucoup plus efficaces et complètes pour trouvr des régions avec des gènes qui affectent les maladies
Seront utilisés en médecine personnalisée

Question 34

Que permettra HapMAp

Answer 34

Identifier des différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
Développer des tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulière
Offrir un traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie

Question 35

Pourquoi développer la médecine personnalisée

Answer 35

Plus de 106 000 personnes meurent aux USA de réactions adverses à des medicaments prescrits correctement
2,2 millions souffrent d’effets secondaires graves
L’utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte génétique et environnemental du patient =Médecine spécialisée