8- Technologies de l'ADN Flashcards
Que sont les enzymes de restriction
Endonucléases coupant l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences spécifiques, dites sites de restriction. Majoritairement des séquences palindromiques
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction
Défense contre les virus des bactéries (bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux
Que peut former la coupure par des enzymes de restriction
Bouts collants (le lien phosphodiester coupé n’est pas au milieu du site de restriction) ou francs
Comment peut-on séparer et identifier les fragments d’ADN coupés après la digestion avec des enzymes de restriction
Séparés selon la taille parélectrophorèse sur gel d’Agarose
Comment migre l’ADN suite à l’application du champ électrique dans le gel d’Agarose
Vers le pôle +, car l’ADN est -
Plus petit ira plus vite, donc + loin
Comment se fait la détection des fragments d’ADN dans un gel
Bromure d’éthidium, un agent intercalant (cancérigène) qui est une molécule fluorescente s’intercalant dans la double hélice, et rayons UV
OU
ADN marqué radioactivement (p32)
Comment joindre les bout coupés par une enzyme de restriction
Ligase
Qu’est-ce que la ligation
Joindre 2 bouts d’ADN
Création d’ADN recombinant au labo en rejoignant n’importe quels fragments d’ADN avec une ligase
Marche pour les bouts collants et francs (efficacité 100x plus faible)
Qu’est-ce que le cloning
Ligation d’un fragment d’ADN dans un vecteur qui se réplique de façon autonome comme un plasmide
C’est quoi un plasmide
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de manière autonome dans un organisme hôte
Il a une origine de réplication fonctionnelle et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication
que contient le plasmide utilisé comme vecteur
Origine de réplication
Gène de sélection (résistance à des antibios) pour sélectionner bactéries contenant le vecteur
Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragemtns d’ADN
Site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN)
Qu’est-ce qu’une transformation
Insérer un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Efficacité de 1/2000, sélectionne cellules ayant le plasmide grâce à l’antibio
Quelles sont les utilisations possibles de l’ADN amplifié
Préparer une grande qté d’insert afin de le séquencer
Poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
Production de protéines recombinantes (insuline humaine, GH humaine), facetris de coagulation, immunogènes pour vaccins, lactase, etc
Qu’est-ce que GFP
Protéine flurorescente de méduse
Fusions de gènes avec GFP permettent d’étudier in vivo:
niveaux de transcription des gènes
niveaux de traduction
Localisation cellulaire de protéines
co-localisation cellulaire
Que permettent les protéines fluorescentes de différentes couleurss
Co-localisation de protéines et de structures cellulaires
Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro?
ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
Dépent d’une matrice - obtenu de la dénaturation thermique d’ADN
Besoin d’amorce - Oligonucléotides ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
Que se passe-t’il à l’ADN avec la hausse de la température
Passe de double à simple brin et l’absorbance monte
Même effet observé avec hausse de pH
Point d”inflexion=Tm
Que se passe-t’il pour la dénaturation d’un ADN poly A-T vs G-C
Poly G-C a besoin de plus d’énergie, car 3 ponts-H au lieu de 2, donc T plus haute requise
ADN WT entre les 2
Qu’est-ce que l’hybridation
L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (hybridation) en ADN double brin lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)
quelle est la méthode de Sanger
Aussi appelée didéoxy
Moyen pour détecter une mutation dans un gène par exemple
On ajoute quelques didéoxyribonucléotides (ddNTP) qui ont un H au lieu de OH au bout 3’, ce qui arrête la réaction de polymérisation
1. Séparation des brins et ajout d’amorce
2. Ajout des amorces, dG, dA, dT, et dC, un des dNTP est marqué pour détection. Ajout d’un des ddNTP par tube et ADN polymérase
3. Séparation sur gel des fragements et détection des brins synthétisés par extension de l’amorce
4. Lecture de la séquence sur gel
Comment est l’amorce dans la méthode du didéoxy
15 à 30 nucléotides, c’est un oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice l’amorce est radioactive ou fluorescente. Pol permet ajoutdes dNTP et polymérise en 3’ de l’amorce
Comment se fait un cycle de PCR
Réaction de polymérisation en chaîne
1. Séparation des brins (95°)
2. Hybridation des amorces (55°)
3. Synthèse par la Taq1 ADN polymérase (72°)
Comment se fait l’amplification par PCR
20-30 cycles de 5 minutes
Taq pol extraite d’une bactérie thermophile
Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30 cycles?
10 = 1024
20 = 1 048 576
30 = 1 073 741 842
