Week 8 (qPCR et Prélèvement de traces)

Question 1

Que sont les étapes de l’analyse de traces biologiques ?

Answer 1

1. Il faut les trouver
2. Il faut avoir une idée sûr leur nature
3. Il faut réussir à les prélever pour les amener au laboratoire pour l’analyse
4. Il faut avoir conscience des erreurs qui peuvent intervenir aux diverses étapes

Question 2

Que sont les paramètres qui limitent le succès des analyses de traces biologiques ?

Answer 2

• La quantité d’ADN
• le degré de dégradation
• la présence de substances interférentes

Question 3

Que sont les caractéristiques du sang ?

Answer 3

Le sang est composé de globules rouges, globules blancs et plaquettes. Les globules rouges contiennent de l’hémoglobine qui est une protéine qui assure le transport de l’oxygène

Question 4

Quels éléments du sang est utile pour séquencer un profil ADN ?

Answer 4

Les globules blancs. Les globules rouges perdent leur noyau après maturation.

Question 5

Combien de globules blancs sont présents dans le sang (cellules/Microlitres) ?

Answer 5

5000 - 10000 par micorlitres

Question 6

Est-ce que le sang à but de transfusion et utilisable pour séquencer des profils d’ADN ?

Answer 6

Non car ils sont déleucocytés

Question 7

Que sont les types de cellules présents dans le sperme et en quelle quantités (cellules par microlitres) ?

Answer 7

• les spermatozoïdes (100 000 cel/microL)
• Les cellules épithéliales
• les leucocytes/globules blancs (100 cel/microL)

Question 8

Qu’est analysé dans la salive à des fins de séquençage d’ADN ?

Answer 8

Les cellules décrochées des parois des glandes salivaires ou des parois buccales (100 cellules par microL)

Question 9

Que sont des exemples de d’échantillions ou l’on peut prélever de l’ADN ?

Answer 9

• les mégôts de cigarettes
• Brosses à dents
• les verres, récipients
• les denrées alimentaires
• chewing-gum
• brosses à dents
• timbres
• rabats d’enveloppes

Question 10

Quand est-ce que l’ADN est séquençé des dents et os ?

Answer 10

Pour l’indentification de cadavres et de victimes de conflicts

Question 11

Pourquoi l’ADN des os et des dents est utile dans des cas de vieux cadavres ou cadavres brûlées ?

Answer 11

Car ils ont des bonnes chances de survie car l’ADN est contenu au milieu de la dent / Os

Même si le tissue est mal conservé on peut toujours séquencer l’ADN mitochondrial qui donne des bons résultats

Question 12

Que sont les caractéristiques des cheveux et poils sous un angle de la science forensique ?

Answer 12

Les cheveux laissés peuvent être utiles pour séquencer l’ADN mitochondrial(bien que les cheveux contiennent beaucoup de kératine qui est un inhibiteur de PCR)

Si les cheveux sont arrachés avec la racine, l’ADN autosomal est séquençable

Question 13

Dans quel cas est-ce que l’ADN dans l’urine est séquencé ?

Answer 13

Pour des cas de doppage pour vérifier que l’urine testé appartient au bon individu.

Question 14

Que sont les cellules présents dans l’urine qui contiennent de l’ADN analysable ?

Answer 14

Des cellules épithéliales décrochés des parois des organes traversés par l’urine (quelques cellules par microL)

Question 15

Est-ce que les ongles sont une bonne source d’ADN ?

Answer 15

Oui très bonne ce qui cause malheuresement souvent des profils de mélange lors d’un cas de défense d’une victime

Question 16

Que sont les trois causes de dégradation de l’ADN (“ennemis”) ?

Answer 16

• l’humidité (eau aide les réactions de dégradation
• La chaleur (accélère toutes les réactions)
• la lumière (rayons UV)

substances chimiques aussi (acides, eau de Javel)

Question 17

Que sont des différents moyens de prélever des traces ?

Answer 17

1. Mini Tapes
2. Écouvillons
3. Papier FTA

Question 18

Que sont des Mini Tapes ?

Answer 18

C’est des bouts de scotch stériles qui sont appliqués sur des surfaces pour prélever des cellules de la peau.

Le scotch est pressé à plusieurs reprises contre l’article pour transférer la trace. Le scotch est ensuite déchiqueté et transferé dans un tube d’extraction prêt à être analysé

Question 19

Que sont des écouvillons ?

Answer 19

Des contons tiges plus longs

Question 20

Comment sont utilisés les écouvillons lors de prélèvements ?

Answer 20

La technique de double swab:
1. Un frottit avec un écouvillon imbibé d’eau
2. Un frottit avec un écouvillon sec
Les deux sont ensuites analysés

Question 21

Comment s’assurer que les prélèvements ne sont pas modifier ?

Answer 21

Après le prélèvement, l’écouvillon est mis dans une boîte en carton offrant de bonnes conditions de séchage, puis son scellés par un autocollant très fragile

Question 22

Qu’est un exemple de prélèvement fait avec des écouvillons ?

Answer 22

Des prélèvements buccaux. Frottement d’un écouvillon sur la paroi buccale

Question 23

Comment fonctionne / est utilisé le papier FTA pour les prélèvements de traces ?

Answer 23

Le prélèvement buccal obtenu par frottement est appliqué sur le papier. Le papier arrive a “casser” les cellules et libérer l’ADN qui est ensuite fixé dans les mailles du papier. Neutralise les bactéries et virus pathogènes

Question 24

Que sont des mesures de prévention de contaminations ?

Answer 24

• locaux et matériel séparés pour les opérations pre/post-PCR
• le port de gants et de masques
• ne pas se tenir au-dessus des échantillons ouverts (perte de cheveux, pellicules ou particules de peau)
• utiliser des filtres de protection sur les instruments utilisés pour prélever les extraits des échantillons pour éviter de transférer des micro-projections d’un échantillon à un autre

Établir des bases de données des profils ADN du personnel des laboratoires et des services de police
Mais il y a une question de confidentialité qui rentre en jeu

Question 25

Que sont des conséquences de contaminations ?

Answer 25

• les fausses exclusions
• les fausses incriminations

Question 26

Qu’est une fausse exclusion ?

Answer 26

Tant que l’ADN contaminant provient d’une personne qui n’est pas suspectée, il n’y a pas de risque qu’il conduise à une fausse incrimination. Mais il pourrait bien conduire à une fausse exclusion d’un coupable

Question 27

Qu’est une fausse incrimination ?

Answer 27

La contamination la plus à craindre est celle qui consisterait à contaminer une trace avec du matériel biologique d’un suspect

Question 28

A partir de quelle quantité est-ce que le composant mineur d’un mélange d’ADN apparaît-il à l’analyse ?

Answer 28

1/10 ou 10%. En dessous de 10% de l’ADN totale du mélange

Question 29

Que sont les types de contrôles utilisés a des fins préventives pour la contamination ?

Answer 29

• Contrôles positifs
• Contrôles négatifs

Question 30

Qu’est un contrôle positif ?

Answer 30

Ce sont des échantillons contenant de l’ADN connu à une concentration connue. Ils permettent de s’assurer que le processus d’analyse fonctionne

Question 31

Qu’est un contrôle négatif ?

Answer 31

Il s’agit déchantillons vides subissant néanmoins exactement les mêmes opérations d’extraction et d’analyse d’ADN que les traces, et qui ne doivent logiquement fournir aucun profil ADN. Si ces contrôles négatifs donnent un profil ADN, cela démontre l’existence d’une contamination

Question 32

Qu’est la qPCR ?

Answer 32

C’est une réaction PCR mais ou l’on peut quantifier l’ADN présent en temps réel en mesurant la quantité d’un marqueur fluorescent.

Question 33

Comment peut-on quantifier la qualité d’une trace d’ADN avec la qPCR ?

Answer 33

En regardant le Ct ou la quantité de cycles qu’une trace prends pour franchir un certain seuil d’ADN présent lors de la PCR.

Cette valeur Ct est inversement proportionnelle au logarithme du nombre d’exmeplaires de l’ADN cible avant le début de la PCR.

Question 34

Que sont les différentes phases de la qPCR ?

Answer 34

1. La phase exponentielle (phase la plus efficace de l’amplification. La quantité d’amplicon double à chaque cycle avec une efficacité de 100%. La concentration d’ADN est déterminée dans cette phase)
2. La phase linéaire (l’éfficacité de la PCR diminue )
3. la phase plateau( la quantité de produit PCR et le signal fluorescent restent constants)

Question 35

Pourquoi est-ce qu’il faut vérifier lors de la phase exponentielle plutôt qu’a la fin pour qualifier la qualité de la trace ?

Answer 35

Car la quantité finale d’ADN ne correspond pas toujours à la quantité initiale. (Voir slide 33)

Question 36

Que peut-être les raisons qu’une trace à un haut Ct ?

Answer 36

• La trace est de pauvre qualité
• La trace contient des inhibiteurs à la PCR

Question 37

Comment la quantification par fluorescence fonctionne dans la qPCR ?

Answer 37

En plus du mélange usuel, des sondes “TaqMan” sont rajoutés à la réaction. Ces sondes sont marquées avec un colorant fluorescent mais portent aussi une molécule ayant la capacité de capturer l’émission fluorescente du colorant (quencher).
Ces sondes se lient sur la brin matrice par complémentarité lors de la dénaturation puis la polymérase (lors de la synthèse du produit) va cleaver la sonde en plusieurs morceaux.
Ce cleavage va assez éloigner le fluorophore du “quencher” pour être détecté.

Question 38

Que sont les cibles du kit Quantifier Trio?

Answer 38

• Une cible longue de l’ADN autosomique
• Une cible courte de l’ADN autosomique
• Une cible chromosomique Y
• Le contrôle interne de l’inhibition (CPI)

Chaque cible à sa propre sonde avec fluorophore de couleur différente=4

Question 39

Que accomplit la cible longue et la cible courte dans le Kit Quantifier Trio pour la qPCR ?

Answer 39

Les deux sont là pour voir si la trace biologique est dégradée.
Si le marqueur long à le même résultat que le court alors il est fort probable que la trace ne soit pas dégradée
Si le résultat est différent il probable que la trace soit dégradée.

Question 40

Que accomplit la cible chromosomique Y dans le Kit Quantifier Trio pour la qPCR ?

Answer 40

Permet de voir s’il y a de l’ADN masculin dans la trace => informer si analyser STR Y ou méthode d’extraction différentielle

Question 41

Qu’est le Contrôle interne d’inhibition ?

Answer 41

C’est de l’ADN synthétique (introuvable dans la nature) qui est quantifié simultanément avec l’échantillon, dans le même tube. Il a ses propres amorces et sondes TaqMan. Permet de voir s’il y a des inhibiteurs dans la trace