Week 6 (PCR, Artefacts et sensibilité)

Question 1

Combien de cellules sont nécessaires en moyenne pour obtenir un bon profil ?

Answer 1

100 cellules ou 500 picogrammes d’ADN

Une cellule pèse environ 6pg

Question 2

Que arrive-t-il quand on a trop peu d’ADN ?

Answer 2

la PCR est sujet aux effets stochastiques. (La variabilité des résultats dû au hasard)

Si on a deux types de balles rouge/ blancs et on en tire 100 les variations au niveau du pourcentage du nombre de balles blanches v rouges vont être plus petites qu’une situation oú on en tire que 4

La situation oú on tire 4 balles est similaire a quand on n’a très peu d’ADN

Question 3

Que peut-il arriver sur la PCR si on n’as pas assez d’ADN ?

Answer 3

Tout les pics du profil sont plus petites mais aussi:
- Peak imbalance
- Allele drop out
- Marker drop out

Question 4

Qu’est une peak imbalance et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?

Answer 4

Quand la PCR n’as pas assez amplifié un allèle comparé à l’autre
Sur l’électrophorégramme un pic est grand et l’autre est beaucoup plus petit

Question 5

Qu’est un allèle drop in et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?

Answer 5

Quand la PCR amplifie autre chose ou une contamination.
Sur l’électrophorégramme il y a un pic qui ne correspond pas à un STR

Question 6

Qu’est un allèle drop out et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?

Answer 6

La PCR n’arrive pas du tout à amplifier un allèle du STR.
Sur l’électrophorégramme, on ne voit que un pic pour un allèle alors qu’il devrait en avoir 2

Question 7

Qu’est un marker drop out et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?

Answer 7

La PCR n’arrive pas à amplifié le gène/le locus tout cours.
Sur l’électrophorégramme, il n’y a rien

Question 8

Comment peut-on détecter les effets stochastiques ?

Answer 8

Si le signal est faible et proche du bruit de fond

Question 9

Comment améliorer la sensibilité lors d’une trace pauvre en ADN ?

Answer 9

1. Augmenter le nombre de cycles PCR jusqu’à 34 cycles. Cela améliore nettement les traces moyenne et faibles
2. On recherche un profil de consensus en faisant plusieurs replications différentes de l’ADN

Question 10

Que sont les risques d’augmenter le nombre de cycles de PCR pour des traces pauvre en ADN ?

Answer 10

Augmente le risque de contaminations

Question 11

Est il mieux de faire une grande analyse ou de les séparer ?

Answer 11

C’est mieux de séparer les analyses

Question 12

Qu’est un stutter ?

Answer 12

C’est un allèle ayant un ou plusieurs éléments répétifs de moins qu l’allèle nominal (produits secondaires non désirés de la PCR)

Question 13

Comment se produit un stutter ?

Answer 13

pendant le copiage un glissement en arrière d’un ou plusieurs nucléotides qui fait que le brin ne copie que 6 répétitions et pas 7.
Ensuite ce brin -1 deviendra matrice et le stutter se prolifère dans le PCR.
Ce problème est très courants dans la PCR car le mécanisme de synthèse de copie est très variable et produits beaucoup d’erreurs qui est multiplié / accélèré encore plus par les 30 cycles in vitro de la PCR.

Question 14

Que sont des solutions pour réduire les stutters ?

Answer 14

1. utiliser des STRs avec des séquences de répétitions assez longues et plusieurs paire de bases (3 ou 4 pb par rep)

Question 15

Qu’est une addition A incomplète ?

Answer 15

L’ADN Polymérase tend à ajouter un nucléotide A au brin d’ADN modèle

Question 16

Comment reconnaître des additions A incomplète ?

Answer 16

Il faut regarder si le problème est généraliser (très probable si c’est généralisé)

Question 17

Que sont des solutions a l’addition A incomplète ?

Answer 17

• Prolonger considérablement le temps du dernier cycle de la PCR pour que l’ADN polymérase ait le temps d’ajouter une A sur chaque copie obtenue en fin de PCR
• Utiliser moins d’ADN. L’addition A incomplète est typique des échantillons avec beaucoup d’ADN

Question 18

Que sont trois artéfactes liés à l’électrophorèse ?

Answer 18

• Dye Blob
• Pull-up
• Spike

Question 19

Qu’est un Dye Blob (colourant recourbé) ?

Answer 19

Les colourants attachés à l’amorce reste normalement accroché à l’ADN mais parfois ils sont libres. On les observent grâce à leur fluorescence
On les voit dans l’électrophorégramme comme des petits pics bien avant les allèles

Question 20

Comment reconnaître un Dye Blob sur un électrophorégramme ?

Answer 20

• la forme du pic
• Dans tous les échantillons de la même couleur, analysé avec le même kit
• Généralement de faible intensité

Question 21

Comment peut-on négliger les effets des Dye-blobs ?

Answer 21

1. Comparer les résultats obtenus avec deux kits différents
2. Entrainer le logiciel pour les reconnaitre

Question 22

Qu’est un Pull-up ?

Answer 22

C’est des contaminations dans l’émission spectrale. L’intensité d’émission du colorant à différentes longueurs d’ondes crée un chevauchement spectral des couleurs qui peut créer des faux piques d’une autre couleur / colorant sur l’électrophorégramme.

Normalement la calibration spectrale de la machine devrait juste prendre le spectre d’émission le plus élevé

Question 23

Comment reconnaître un Pull-up ?

Answer 23

• La position et alignement de pics entre différentes couleurs
• Le pic qui contamine est de forte intensité

Question 24

Que sont des solutions pour des Pull-ups ?

Answer 24

• Analyser moins de produit PCR (réduire l’injection au séquenceur )
• Refaire la calibration spectrale
• Utiliser des colorants avec des longueur d’émissions loins des autres

Question 25

Qu’est un spike ?

Et les deux types ?

Answer 25

L’injection d’une impureté, visible dans toutes les couleurs / instabilité électrique lié au voltage

Question 26

Comment reconnaître un Spike ?

Answer 26

• La forme du pic est très pointue
• Visible dans toutes les couleurs

Question 27

Qu’est la solution pour un Spike ?

Answer 27

Il faut refaire l’électrophorèse de l’échantillon