Week 6 (PCR, Artefacts et sensibilité) Flashcards
Combien de cellules sont nécessaires en moyenne pour obtenir un bon profil ?
100 cellules ou 500 picogrammes d’ADN
Une cellule pèse environ 6pg
Que arrive-t-il quand on a trop peu d’ADN ?
la PCR est sujet aux effets stochastiques. (La variabilité des résultats dû au hasard)
Si on a deux types de balles rouge/ blancs et on en tire 100 les variations au niveau du pourcentage du nombre de balles blanches v rouges vont être plus petites qu’une situation oú on en tire que 4
La situation oú on tire 4 balles est similaire a quand on n’a très peu d’ADN
Que peut-il arriver sur la PCR si on n’as pas assez d’ADN ?
Tout les pics du profil sont plus petites mais aussi:
- Peak imbalance
- Allele drop out
- Marker drop out
Qu’est une peak imbalance et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?
Quand la PCR n’as pas assez amplifié un allèle comparé à l’autre
Sur l’électrophorégramme un pic est grand et l’autre est beaucoup plus petit
Qu’est un allèle drop in et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?
Quand la PCR amplifie autre chose ou une contamination.
Sur l’électrophorégramme il y a un pic qui ne correspond pas à un STR
Qu’est un allèle drop out et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?
La PCR n’arrive pas du tout à amplifier un allèle du STR.
Sur l’électrophorégramme, on ne voit que un pic pour un allèle alors qu’il devrait en avoir 2
Qu’est un marker drop out et à quoi ressemble-t-elle dans un électrophorégramme ?
La PCR n’arrive pas à amplifié le gène/le locus tout cours.
Sur l’électrophorégramme, il n’y a rien
Comment peut-on détecter les effets stochastiques ?
Si le signal est faible et proche du bruit de fond
Comment améliorer la sensibilité lors d’une trace pauvre en ADN ?
- Augmenter le nombre de cycles PCR jusqu’à 34 cycles. Cela améliore nettement les traces moyenne et faibles
- On recherche un profil de consensus en faisant plusieurs replications différentes de l’ADN
Que sont les risques d’augmenter le nombre de cycles de PCR pour des traces pauvre en ADN ?
Augmente le risque de contaminations
Est il mieux de faire une grande analyse ou de les séparer ?
C’est mieux de séparer les analyses
Qu’est un stutter ?
C’est un allèle ayant un ou plusieurs éléments répétifs de moins qu l’allèle nominal (produits secondaires non désirés de la PCR)
Comment se produit un stutter ?
pendant le copiage un glissement en arrière d’un ou plusieurs nucléotides qui fait que le brin ne copie que 6 répétitions et pas 7.
Ensuite ce brin -1 deviendra matrice et le stutter se prolifère dans le PCR.
Ce problème est très courants dans la PCR car le mécanisme de synthèse de copie est très variable et produits beaucoup d’erreurs qui est multiplié / accélèré encore plus par les 30 cycles in vitro de la PCR.
Que sont des solutions pour réduire les stutters ?
- utiliser des STRs avec des séquences de répétitions assez longues et plusieurs paire de bases (3 ou 4 pb par rep)
Qu’est une addition A incomplète ?
L’ADN Polymérase tend à ajouter un nucléotide A au brin d’ADN modèle
Comment reconnaître des additions A incomplète ?
Il faut regarder si le problème est généraliser (très probable si c’est généralisé)
Que sont des solutions a l’addition A incomplète ?
- Prolonger considérablement le temps du dernier cycle de la PCR pour que l’ADN polymérase ait le temps d’ajouter une A sur chaque copie obtenue en fin de PCR
- Utiliser moins d’ADN. L’addition A incomplète est typique des échantillons avec beaucoup d’ADN
Que sont trois artéfactes liés à l’électrophorèse ?
- Dye Blob
- Pull-up
- Spike
Qu’est un Dye Blob (colourant recourbé) ?
Les colourants attachés à l’amorce reste normalement accroché à l’ADN mais parfois ils sont libres. On les observent grâce à leur fluorescence
On les voit dans l’électrophorégramme comme des petits pics bien avant les allèles
Comment reconnaître un Dye Blob sur un électrophorégramme ?
- la forme du pic
- Dans tous les échantillons de la même couleur, analysé avec le même kit
- Généralement de faible intensité
Comment peut-on négliger les effets des Dye-blobs ?
- Comparer les résultats obtenus avec deux kits différents
- Entrainer le logiciel pour les reconnaitre
Qu’est un Pull-up ?
C’est des contaminations dans l’émission spectrale. L’intensité d’émission du colorant à différentes longueurs d’ondes crée un chevauchement spectral des couleurs qui peut créer des faux piques d’une autre couleur / colorant sur l’électrophorégramme.
Normalement la calibration spectrale de la machine devrait juste prendre le spectre d’émission le plus élevé
Comment reconnaître un Pull-up ?
- La position et alignement de pics entre différentes couleurs
- Le pic qui contamine est de forte intensité
Que sont des solutions pour des Pull-ups ?
- Analyser moins de produit PCR (réduire l’injection au séquenceur )
- Refaire la calibration spectrale
- Utiliser des colorants avec des longueur d’émissions loins des autres
Qu’est un spike ?
Et les deux types ?
L’injection d’une impureté, visible dans toutes les couleurs / instabilité électrique lié au voltage
Comment reconnaître un Spike ?
- La forme du pic est très pointue
- Visible dans toutes les couleurs
Qu’est la solution pour un Spike ?
Il faut refaire l’électrophorèse de l’échantillon
