Week 2 Méthodes d'analyse de base Flashcards
Tous les protocoles d’extraction commencent par quoi ?
lyser les cellules présentes dans l’échantillon pour libérer l’ADN
Qu’est l’étape cruciale pour le processus d’obtention d’ADN ?
La phase d’extraction
Que utilise-t-on pour extraire de l’ADN ?
- Le SDS (sodium dodecyl sulfate)
- La protéinase K
- Ébullition (90-95C)
Qu’est le SDS ?
C’est un détergent anionique qui perturbe les interactions non covalentes des protéines
Qu’est la protéinase K ?
C’est une enzyme capable de dégrader les protéines
Que sont les 4 méthodes d’extraction vu en cours ?
- Purification de l’ADN à base de silice
- Purification de l’ADN au Phénol-chloroforme
- Extraction de l’ADN en Papier FTA
- Extraction de l’ADN en différentielle
Comment fonctionne la purification de l’ADN à base de silice ?
L’ADN se lie à la membrane de gel-silice grace à une centrifugation. Les protéines et autre impuretés sont ensuite éliminées au cours de deux centrifugations en présence d’un tampon de lavage. L’ADN est ensuite récupéré dans un tube neuf grâce à une centrifugation en présence d’un tampon d’élution de pH basique et faible en concentration ionique
Pourquoi est-ce que l’ADN ne se lie pas directement à la membrane ?
Lors de la purification à base de silice
Pour que l’ADN peut plus facilement se détacher à la fin
Comment fonctionne la purification de l’ADN en Phénol-chloroforme ?
On ajoute le mélange de phénol et de chloroforme à la trace lysée. Ensuite la centrifugation permet de séparer l’ADN qui est soluble dans la phase aqueuse (superieure) et les restes (protéines / lipides ) dans la phase organique (inférieure). Ensuite l’ADN est récupérée
Que sont des caractéristiques de la purification au phénol-chloroforme ?
- Un long protocole d’extraction
- L’utilisation de produits chimiques toxiques
- Nécessite une étape de concentration de l’extrait
- Perte d’une partie de l’ADN au niveau de l’interphase organique/aqueuse
- Extrait d’ADN relativement pur
- Possibilité d’extraire un échantillon de grande taille
Pour quelles circonstances est-ce que l’extraction au phénol-chloroforme est-il utilisé ?
Pour des cas où on a des surfaces avec des traces assez grandes mais on ne sait pas où (textiles, gants)
Comment fonctionne l’extraction de l’ADN avec le papier FTA ?
On utilise le papier absorbant qui contient des substances chimiques capables de préserver de l’ADN des Nucléases et d’empêcher la croissance des bactéries.
- La traces (sang) est déposé sur le papier FTA est sèche. L’ADN de la trace se lie à la matrice du papier
- On prend une petite partie du papier puis on le lave plusieurs fois
- On enlève le supernatant puis on n’a plus que l’ADN
Que sont des caractéristiques du papier FTA ?
- Permet de conserver la salive et le sang à température ambiante pendant plusieurs années
- Le protocole d’extraction est rapide
- La récupération d’une proportion importante de l’ADN de départ (peu de pertes)
- La quantité d’ADN extrait généralement constante (selon la taille du punch)
Pourquoi est-ce que le FTA n’est pas la façon préférée pour traités de traces biologiques ?
Parce que la plupart des traces sont déjà sèches donc ne peuvent pas être facilement transférer sur du FTA.
Comment fonctionne l’extraction de l’ADN différentielle ?
- Une solution de SDS et protéinase K est utilisé pour lyser les cellules. les spermatozoïdes résistent à cette lyse. Les cellules épithéliales sont lysées
- L’ajout de DDT aux spermatozoïdes séparés permet de rompre les ponts disulfures des protéines qui lie le noyau l’ADN et d’en extraire l’ADN
Sur quelles genre de traces est l’extraction différentielle utilisée ?
Sur des mélanges d’ADN majoritairement féminin et des spermatozoïdes
Que sont des caractéristiques du système Differex ?
- Extrait d’ADN de bonne qualité
- Séparations efficace des fractions spermatiques et épithéliales
En cas de plusieurs aggresseurs les spermatozoïdes sont toujours mélangé
Que sont les trois étapes de la PCR ? Et que se passe-t-il ?
- La Dénaturation (95C): Séparation des deux brins d’ADN
- L’hybridation (55-60C): Les amorces se lient au site d’élongation
- L’Elongation (72C): Les nucléotides se lient à l’amorce et le brin complémentaire
Que sont des outils nécessaires pour la PCR ?
- l’ADN polymérase
- Les amorces / primers
- Les nucléotides
Qu’est l’ADN polymérase ?
C’est une enzyme de copiage d’ADN qui à la capacité d’accrocher des nucléotides les uns aux autres en se servant d’un brin d’ADN comme modèle
Que sont des amorces pour la PCR ?
C’est un groupe de nucléotides synthétique qui vont encadrer la zone d’ADN à copier et ainsi diriger le travail de copiage de l’ADN polymérase
Qu’est utilisé pour faire de la PCR ?
Des thermocyclers
De quelle entité est-ce que l’ADN polymérase est-elle extraite ?
Thermus aquaticus. Cette polymérase résiste aux températures élevées de la PCR, supprimant la nécessité d’en rajouter à chaque cycle.
Qu’est l’électrophorèse ?
C’est une technique permettant de séparer les molécules de différent taille par leurs différences de mobilité dans un champ électrique
