Week 2 Méthodes d'analyse de base

Question 1

Tous les protocoles d’extraction commencent par quoi ?

Answer 1

lyser les cellules présentes dans l’échantillon pour libérer l’ADN

Question 2

Qu’est l’étape cruciale pour le processus d’obtention d’ADN ?

Answer 2

La phase d’extraction

Question 3

Que utilise-t-on pour extraire de l’ADN ?

Answer 3

• Le SDS (sodium dodecyl sulfate)
• La protéinase K
• Ébullition (90-95C)

Question 4

Qu’est le SDS ?

Answer 4

C’est un détergent anionique qui perturbe les interactions non covalentes des protéines

Question 5

Qu’est la protéinase K ?

Answer 5

C’est une enzyme capable de dégrader les protéines

Question 6

Que sont les 4 méthodes d’extraction vu en cours ?

Answer 6

• Purification de l’ADN à base de silice
• Purification de l’ADN au Phénol-chloroforme
• Extraction de l’ADN en Papier FTA
• Extraction de l’ADN en différentielle

Question 7

Comment fonctionne la purification de l’ADN à base de silice ?

Answer 7

L’ADN se lie à la membrane de gel-silice grace à une centrifugation. Les protéines et autre impuretés sont ensuite éliminées au cours de deux centrifugations en présence d’un tampon de lavage. L’ADN est ensuite récupéré dans un tube neuf grâce à une centrifugation en présence d’un tampon d’élution de pH basique et faible en concentration ionique

Question 8

Pourquoi est-ce que l’ADN ne se lie pas directement à la membrane ?

Lors de la purification à base de silice

Answer 8

Pour que l’ADN peut plus facilement se détacher à la fin

Question 9

Comment fonctionne la purification de l’ADN en Phénol-chloroforme ?

Answer 9

On ajoute le mélange de phénol et de chloroforme à la trace lysée. Ensuite la centrifugation permet de séparer l’ADN qui est soluble dans la phase aqueuse (superieure) et les restes (protéines / lipides ) dans la phase organique (inférieure). Ensuite l’ADN est récupérée

Question 10

Que sont des caractéristiques de la purification au phénol-chloroforme ?

Answer 10

• Un long protocole d’extraction
• L’utilisation de produits chimiques toxiques
• Nécessite une étape de concentration de l’extrait
• Perte d’une partie de l’ADN au niveau de l’interphase organique/aqueuse
• Extrait d’ADN relativement pur
• Possibilité d’extraire un échantillon de grande taille

Question 11

Pour quelles circonstances est-ce que l’extraction au phénol-chloroforme est-il utilisé ?

Answer 11

Pour des cas où on a des surfaces avec des traces assez grandes mais on ne sait pas où (textiles, gants)

Question 12

Comment fonctionne l’extraction de l’ADN avec le papier FTA ?

Answer 12

On utilise le papier absorbant qui contient des substances chimiques capables de préserver de l’ADN des Nucléases et d’empêcher la croissance des bactéries.

1. La traces (sang) est déposé sur le papier FTA est sèche. L’ADN de la trace se lie à la matrice du papier
2. On prend une petite partie du papier puis on le lave plusieurs fois
3. On enlève le supernatant puis on n’a plus que l’ADN

Question 13

Que sont des caractéristiques du papier FTA ?

Answer 13

• Permet de conserver la salive et le sang à température ambiante pendant plusieurs années
• Le protocole d’extraction est rapide
• La récupération d’une proportion importante de l’ADN de départ (peu de pertes)
• La quantité d’ADN extrait généralement constante (selon la taille du punch)

Question 14

Pourquoi est-ce que le FTA n’est pas la façon préférée pour traités de traces biologiques ?

Answer 14

Parce que la plupart des traces sont déjà sèches donc ne peuvent pas être facilement transférer sur du FTA.

Question 15

Comment fonctionne l’extraction de l’ADN différentielle ?

Answer 15

1. Une solution de SDS et protéinase K est utilisé pour lyser les cellules. les spermatozoïdes résistent à cette lyse. Les cellules épithéliales sont lysées
2. L’ajout de DDT aux spermatozoïdes séparés permet de rompre les ponts disulfures des protéines qui lie le noyau l’ADN et d’en extraire l’ADN

Question 16

Sur quelles genre de traces est l’extraction différentielle utilisée ?

Answer 16

Sur des mélanges d’ADN majoritairement féminin et des spermatozoïdes

Question 17

Que sont des caractéristiques du système Differex ?

Answer 17

• Extrait d’ADN de bonne qualité
• Séparations efficace des fractions spermatiques et épithéliales

En cas de plusieurs aggresseurs les spermatozoïdes sont toujours mélangé

Question 18

Que sont les trois étapes de la PCR ? Et que se passe-t-il ?

Answer 18

1. La Dénaturation (95C): Séparation des deux brins d’ADN
2. L’hybridation (55-60C): Les amorces se lient au site d’élongation
3. L’Elongation (72C): Les nucléotides se lient à l’amorce et le brin complémentaire

Question 19

Que sont des outils nécessaires pour la PCR ?

Answer 19

• l’ADN polymérase
• Les amorces / primers
• Les nucléotides

Question 20

Qu’est l’ADN polymérase ?

Answer 20

C’est une enzyme de copiage d’ADN qui à la capacité d’accrocher des nucléotides les uns aux autres en se servant d’un brin d’ADN comme modèle

Question 21

Que sont des amorces pour la PCR ?

Answer 21

C’est un groupe de nucléotides synthétique qui vont encadrer la zone d’ADN à copier et ainsi diriger le travail de copiage de l’ADN polymérase

Question 22

Qu’est utilisé pour faire de la PCR ?

Answer 22

Des thermocyclers

Question 23

De quelle entité est-ce que l’ADN polymérase est-elle extraite ?

Answer 23

Thermus aquaticus. Cette polymérase résiste aux températures élevées de la PCR, supprimant la nécessité d’en rajouter à chaque cycle.

Question 24

Qu’est l’électrophorèse ?

Answer 24

C’est une technique permettant de séparer les molécules de différent taille par leurs différences de mobilité dans un champ électrique