Week 4- qPCR primer Flashcards
kalibratie
Verdunningsreeks (logaritmisch) van bekende concentraties. De concentraties moeten binnen bereik monster ligt.
Eisen primer
16-24 nucleotiden lang;
GC gehalte 45-60%
Voorkom 3 G of C’s achter elkaar
Nier complimentair
Tm primers binnen 1 graad van elkaar
Waarom primers
Nodig voor amplificatie. Bouwen de nucleotide in op het gewenste stuk.
Waarom primer 16-24 nucleotide lang?
Maakt het vrij specifiek voor target DNA. Te weinig - meerdere plekken binden. Te veel - efficiëntie steeds minder.
Waarom GC gehalte 45-60%?
Bij teveel komen er drie WSB en wordt de temperatuur te hoog om de primer weer los te krijgen.
Waarom niet 3 G of C’s achter elkaar of op het einde van je primer?
De GC’s zorgen voor 3 WSB en die bindingen zijn zo sterk dat de rest niet uitmaakt waardoor je mismatches krijgt en bindt de rest van je primer op een andere verkeerde plek.
Waarom mogen je primers niet complimentair zijn aan elkaar?
Hairpins (zelfbinding) en Primer-dimers (Primers binden aan elkaar)
Waarom Tm primers binnen 1 graad van elkaar?
Alu elementen
Een soort van de verdeling van STR. Valt onder SINEs (Short interspersed nuclear elements); 10% genoom, repeats, primaat specifiek en kan ook humaan specifiek.
