Week 4 - QPCR II

Question 1

Opbouw QPCR curve

Answer 1

Baseline - onder treshold line, weinig fluoriscentie
Exponentieel - efficiëntie is optimaal door vele reagens en geen concurrerende primers.
Linear - Effieciëntie neemt af door afname reagens.
Plateau - bijna geen amplificatie meer

Question 2

SYBR GREEN

Answer 2

Bindt aan minor grove in dsDNA. Absorptie op 480 nm (blauw). Emissie op 520 nm (groen).

Question 3

Structuur DNA

Answer 3

Minor groove en Major groove. Dit komt omdat de suikerfosfaatgroepen niet helemaal in het midden liggen en wanneer dit gedraaid wordt wordt de ene kant groter dan de andere kant

Question 4

Melting Curve

Answer 4

Detecteert of er meerdere producten in sample zit. Dit wordt toegepast bij SYBRGREEN. 1 piek = qPCR zeer specifiek
meerder pieken = meerdere producten

Question 5

Meerdere pieken melting curve

Answer 5

Er zijn meerdere producten in sample, meestal twee. Meestal primer dimers (primers binden aan elkaar). Primers moeten specifieker worden ontworpen. Er kunnen ook gebieden in zitten die veel G/C’s bevatten en hebben een hogere temperatuur om los te komen.

Question 6

TAGMAN Probe

Answer 6

enkelstrengs DNA dat je maakt voor een specifieke sequentie tussen FP (3-5) en RP (5-3). Quencher dimt fluorchroom (reporter). Bij amplificatie gaat de probe kapot en kan fluoriscentie gemeten worden.
nadeel; duur
voordeel; specifiek, multiplex

Question 7

Effiecientie

Answer 7

90 - 110% - er buiten nieuwe analyse
(10^(-1/slope)-1 *100%
100% –> helling -3.32
Hoeveelheid DNA dat verdubbeld is in sample.
<90%: primers werken niet goed, geen optimale omstandigheden PCR
>100%: primer dimers, extra ongewenste PCR product/contaminatie

Question 8

Slope helling

Answer 8

maat van efficientie reactie

Question 9

R2 waarde

Answer 9

determinatiecoëfficiënt: hoe goed het model past bij je data. 0.995 is minimum.