week 3 Flashcards
1
Q
Wat kan er aan de hand zijn bij een toegenomen aantal witte bloedcellen in bloed?
A
- Normale reactie van het lichaam op bv een infectie of ontstekingsprocessen
- Leukemie
2
Q
Wat kunnen de reacties zijn van een cel na DNA schade?
A
- Aanzetten van DNA herstel-mechanismen
- Incorrect DNA schade herstel: cel gaat dood
- Incorrect DNA schade herstel/cel gaat niet dood: mutaties gevolgd door transformatie
3
Q
Welke 2 vormen van DNA schade zijn er?
A
- Waarneembraar met een microscoop: chromosoom afwijkingen: 40% van de leukemieën
- Niet waarneembaar met een microscoop: puntmutaties, microdeleties, microinserties etc
4
Q
Wat is bij iedere patiënt met CML te zien?
A
Bij iedere patiënt met CML is te zien dat chromosoom 22 (philadelphia chromosoom) wat korter is geworden en chromosoom 9 wat langer. –> ze ruilen met elkaar, stuk van 22 naar 9, stuk van 9 naar 22
5
Q
Waar liggen BCR en ABL op en waar vindt de breuk plaats?
A
BCR ligt op chromosoom 22, ABL ligt op chromosoom 9
De breuk vindt altijd plaats op BCR in chromosoom 22(2 mogelijke plekken) en op ABL in chromosoom 9 (altijd op zelfde intron)
Het gevolg is een fusie gen –> dit leidt tot een fusie-eiwit –> dit eiwit komt tot expressie in cytoplasma en is een enzym die andere eiwitten weer beïnvloedt
6
Q
Wat doet BCR-ABL?
A
Enzym dat fosforyleert andere eiwitten en dat gefosforyleerde target eiwit verhuist naar de kern en zorgt dat er een versnelde celdeling optreedt in die getransformeerde cel
7
Q
Wat doet Imatinib?
A
Imatinib blokkeert de functie van het BCR-ABL eiwit –> past precies daar waar ATP past (zelfde affiniteit) –> fosforylering kan dan niet plaatsvinden
8
Q
Wanneer is er imatinib resistentie?
A
Mutaties in het ABL1 gedeelte van het BCR-ABL fusie eiwit –> imatinib past niet meer
9
Q
Welke behandelingen kunnen gegeven worden bij CML?
A
- Imatinib
- Dasatinib, nilotinib, ponatinib (alternatieven voor als imatinib bij mensen niet werkt, T315I)
- Stamceltransplantatie
Beloop in geval TKI niet meer werken: overgang naar acceleratie fase en blasten fase. Blastenfase is moeilijker te behandelen.
10
Q
Wat zie je bij alle AML patiënten?
A
Bij alle AML patiënten zie je heel veel blasten, beetje hetzelfde beeld.
AML gedraagt zich bij elke patiënt anders
11
Q
Waar wordt de prognose van AML op gebaseerd?
A
De prognose van AML wordt gebaseerd op chromosoomafwijkingen
12
Q
Wat wordt bij meer dan 95% van de gevallen van CML gezien en waar leidt dit toe?
A
- Bij CML wordt bij meer dan 95% van de gevallen een translocatie t(9;22) (philadelphia chromosoom) waargenomen.
- Als gevolg van deze translocatie wordt een fusie-gen BCR-ABL gevormd.
13
Q
Wat is een chromosoom?
A
DNA, histonen, andere eiwitten
14
Q
Wat bevat DNA?
A
genen (ong 2% van het totale DNA), centromeer, telomeren
15
Q
Hoe is het DNA verpakt?
A
Elke cel bevat ongeveer 2 meter DNA, ingepakt in een kern van ong 10 micrometer doorsnede
Het DNA zit om histonen gewikkeld, die ook weer ingepakt zitten, we zien dit als chromosomen (alleen tijdens mitose, celdeling)
16
Q
Wat zijn de fasen van de celcyclus?
A
G1: celgroei
S: verdubbeling van het DNA
G2: klaarmaken voor mitose
M: uitverdeling van de chromosomen over de dochtercellen
17
Q
Wat zijn de fasen van de mitose?
A
- Profase
- Prometafase
- Metafase
- Anafase
- Telofase
- Cytokinese
18
Q
Hoe worden de chromosomen uit elkaar getrokken?
A
- De centrosoom wordt verdubbeld in de S fase
- In de mitose gaan beide centrosomen uit elkaar
- Spoeldraden (microtubule) komen uit het centrosoom en worden aan het chromosoom vastgemaakt (kinetochoor)
- Als alles vast zit begint de anafase
19
Q
Welke technieken zijn er om chromosomen te kunnen zien?
A
- Alle chromosomen aankleuren (bv R bandering)
- In situ hybridisatie (FISH)
- Chromosoom specifieke probes (FISH)
- Speciale karyotypering (SKY)
20
Q
Welke structurele chromosomale afwijkingen kunnen er zijn?
A
- Deleties
- Translocaties
- Dicentrische chromosomen
21
Q
Hoe ontstaan structurele chromosomale afwijkingen?
A
Breuken in het DNA (door de hele celcyclus)
* Translocaties
* Deleties
* Dicentrische chromosomen
* Etc.
22
Q
Wat gebeurt er met een dicentrisch chromosoom?
A
- Chromosomen worden in de metafase uit elkaar getrokken
- Dit gaat in ongeveer 50% van de gevallen fout bij dicentrische chromosomen –> beide centrosomen gaan een andere kant op –> wordt hard aan getrokken –> breekt uiteindelijk –> gebroken chromosoom –> er kan opnieuw translocatie optreden in volgende cel
- Dus de dicentrische chromosomen geven veel chromosomale instabiliteit, maar blijven niet lang behouden (na uit elkaar trekken, zijn ze weg)
23
Q
Hoe ontstaan numerieke afwijkingen?
A
- Chromosoomverlies
- Chromosoomduplicatie
- In de metafase worden alle chromosomen vastgemaakt
- Als een chromosoom niet vast zit voordat de uitverdeling begint, dan kan er een chromosoom te veel of te weinig in de dochtercel komen (non-disjunctie)
24
Q
Hoe ontdek je numeriek afwijkingen?
A
- In het karyogram
- Analyse van (CA)n repeats (microsatellieten zijn stukken (sequenties) in het DNA waarbij een flink aantal repeats achter elkaar liggen, de repeats verschillen tussen mensen, kijken welk stuk van de chromosoom afwezig of aanwezig is in de tumor)
- Bij NGS: verlies van Single Nucleotide Polymorphisms
25
Hoe ontstaat een deletie?
* Eerst een dubbelstrengs breuk in het DNA
* Dan mitose
* Het stukje chromosoom zonder centromeer wordt niet goed uitverdeeld
* Dan krijg je een heel chromosoom of een stuk chromosoom dat in het midden blijft liggen --> er wordt een micronucleus gemaakt, een stuk kern wat loszit van de echte kern (bevat niet het DNA uit het midden) --> is heel instabiel en wordt snel afgebroken
* Er ontstaat een cel die een (stuk) chromosoomarm mist
26
Wat is chromothripsis?
* Chromosomen kunnen in kleine stukjes breken en weer aan elkaar gezet worden: chromothripsis --> worden op een hele gekke manier weer aan elkaar gezet (stukjes kunnen verloren gaan etc)
* Dit kan gebeuren met 1 chromosoom of met meerdere
* Vaak in laat stadium tumoren
27
Hoe gaat de regulatie van replicatie?
* Het hele chromosoom moet precies één keer per celcyclus verdubbeld worden
* Replicatie gebeurt vanag 'origin of replication'
* Elke origin moet maar 1 keer per S-fase starten met verdubbeling
* Er kan genamplificatie zijn: vaker hetzelfde stukje DNA verdubbelen
28
Wat is genamplificatie?
* Het hele chromosoom moet precies één keer per celcyclus verdubbeld worden
* Als dat niet gebeurt, komen er meerdere kopieën van een deel van het chromosoom (een of enkele genen)
* Dit kun je zien als homogeen kleurende gebieden of 'dubbel minute' chromosomen
29
Wat is tumorigenese?
* Activering van oncogenen door:
→ Translocatie
→ Verdubbeling van chromosoom
→ Genamplificatie
· Inactivering van tumor suppressor genen door:
→ Deletie
→ Verlies van chromosoom
30
Wat zijn telomeren en wat kan ermee misgaan?
· 6 nucleotide repeat aan het uiteinde
· Zorgt ervoor dat het uiteinde (T-loop) weer in zichzelf terugkomt --> beschermt tegen allerlei soorten van afbraak en dat het niet herkent wordt als breuk
· Stabiele structuur aan het eind van het chromosoom
· Zonder de beschermende werking van telomeren zijn DNA uiteinden 'zichtbaar' voor de cel
· Het gevolg hiervan is dat het wordt herkend als dubbelstrengs breuk en die telomeren aan elkaar worden gezet (aan elkaar verbinding uiteinden, koppeling 2 chromosomen aan elkaar) en je dus dicentrische chromosomen krijgt, dit wordt gedaan door niet-homologe end joining
· T-loop is dus nodig om te voorkomen dat telomeer als breuk wordt herkend door NHEJ
· Telomeren worden elke celdeling ietsje korter --> goed anti-kanker mechanisme, want deling beperkt
31
Wat kunnen stamcellen met hun telomeren?
· Stamcellen raken hun telomeren elke celdeling kwijt, maar gebruikt telomerase om de telomeren weer langer te maken
32
Wat is alternatieve telomeerverlenging?
· 85-90% van alle tumoren brengt telomerase tot expressie --> telomeren weer verlengen --> meer delingen
· Waarom niet 100%?
· Er zijn ook nog andere mechanismen om telomeren te verlengern: ALT mechanisme
· Hiervan is niet (precies) bekend hoe het werkt
33
Waarom is het belangrijk om chromosomale afwijkingen te achterhalen bij leukemie?
* Relevant voor diagnose
* Bepalend voor prognose
* Gerelateerd aan respons op chemotherapie
* Nieuwe genen identificeren die informatie geven over hoe leukemie ontstaat, hoe hematopoiese werkt, dit kan helpen voor nieuwe behandelingen ontwikkelen
34
Hoe kan je chromosomale afwijkingen detecteren?
* Klassieke cytogenetica (banderings technieken)
* Moleculaire cytogenetica: FISH en SNP array
* Moleculaire diagnostiek
35
Wat is een terminale deletie?
Een deletie aan het einde van een chromosoom
36
Wat is een interstitiele deletie?
Een deletie middenin het chromosoom
37
Wanneer heeft AML een slecht risico?
* Rond 1990: slecht risico bij complex karyotype (meer dan 3 verschillende chromosoomafwijkingen in tumorcellen) en enkele andere afwijkingen
* Rond 2008: nieuwe risico groep: monosomaal karyotype
→ Twee monosomieën (geen X of Y)
OF
→ 1 monosomie en een structurele afwijking
→ Zeer slecht risico, overall survival 7%
→ Later bevestigd in 4 grote studies met OS tussen 4 en 10%
→ Slechte overleving ondanks behandeling met allogene transplantatie
38
Wat is FISH?
· Fluorescence in situ hybridization
· Probe selectie --> fluorescerend labeltje
· Probe wordt gedenaturiseerd --> vindt complementaire stuk in patienten chromosoom --> stuk dna onder probe zichtbaar maken
39
Waar gebruiken we FISH voor?
· Microdeleties detecteren
· Breukpunten verder definiëren
· Detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen
· Snelle diagnostische detectie op interfase nuclei/kernen
· Klein aantal afwijkende cellen aantonen
40
Wat zijn de nadelen van FISH?
· Beperkte sensitiviteit
· Alleen antwoorden op gestelde vragen
· Niet veel doelen/targets op hetzelfde moment
41
Wat zijn de problemen met multipele myelomen?
· Multipel myeloom zijn maligniteiten van de plasmacellen
· Moeizaam chromosoom onderzoek
· Laag (0,1-10%) percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat
· Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities
· Resultaat: vaak een normaal karyotype, met afwijjkende FISH op interfase kernen
· Aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch)
· Oplossing: hoger percentage plasmacellen nodig --> zuivering van de plasmacellen
42
Hoe kunnen plasmacellen gezuiverd worden?
· Rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis
· Zuivering met anti-CD138 kit (stem cell technologies) --> CD138 komt voor op plasmacellen
Resolutie ongebalanceerde chromosoomafwijkingen is hoger
43
Wat is SNPs?
· Single nucleotide polymorphism
· Plek in genoom waarbij je op 1 basepositie zowel de ene als een andere base kan hebben zonder dat dat tot klinische gevolgen leidt
44
Welke afwijking kan je met een SNP array wel zien en met FISH niet?
LOH
45
Welke afwijking kan je met FISH wel zien en met SNP array niet?
translocatie
46
Wat is de G1 fase?
* Fysieke groei van de cel
* Restrictiepunt: besluit om replicatie te starten
47
Wat is de S fase?
Duplicatie van de chromosomen
48
Wat is de G2 fase?
Voorbereiding op celdeling
49
Wat is de M fase?
Celdeling
50
Welke 3 soorten genen zijn betrokken bij de celcyclus regulatie?
* Cyclines
* Cycline afhankelijke kinases (CDKs)
* Cycline afhankelijke kinase remmers (CKIs)
51
Wanneer is cycline D betrokken?
Bij de activatie van de celcyclus in G1 (na groeisignaal)
52
Wanneer is cycline E betrokken?
Op de overgang naar, en voortgang van S-fase
53
Wanneer is cycline A betrokken?
Progressie door S-fase
54
Wanneer is cycline B betrokken?
Overgang naar M-fase
55
Hoe controleren cyclines de voortgang van de celcyclus?
Door activering van CDK enzymen
56
Wat zijn de kenmerken van de cyclin-dependent kinases (CDKS)?
* Continue aanwezig
* Alleen actief in complex met cylines (fasering)
* Fosforyleren eiwitten nodig voor celcyclus progressie
57
Wat gebeurt er als cycline D aan CDK4 bindt?
Cycline D bindt aan CDK4 --> eiwitten gefosforyleerd voor activatie celcyclus
58
Wat zijn de kenmerken van cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs)?
* Binden aan cyclin/CDK complexen
* Remmen kinase activiteit
* Vnl in G1-fase of na signalen van buitencel of na DNA schade
59
Wat zijn checkpoints?
Momenten in de celcyclus waarop gecheckt wordt of alles oke is
60
Welke checkpoints zijn er en welke eiwitten zijn erbij betrokken?
* Restrictie-punt --> RB
* G1/S --> p53
* Intra S --> ATM
* Anafase --> BUB1
61
Wat is het restrictie-punt?
Cel gaat beslissen of die wel of niet gaat delen
* Wel/niet meer delen?
* Specialiseren?
62
Hoe gaat de signaaltransductie voor celdeling?
1. Groeifactor
2. Groeifactor-receptor (celmembraan)
3. Doorgave signaal (cytoplasma --> kern)
4. Activatie genen betrokken bij de celdeling
63
Wat doet EGF?
Groeisignaal EGF --> via RAS --> het niveau van cycline D gaat omhoog --> cycline D / CDK4 complex actief --> signaal cel gaat delen
64
Wat is E2F?
* Transcriptie factor
* Reguleert expressie van genen nodig in de S fase
65
Wanneer is E2F inactief?
Als het gebonden is aan pRB
pRB gefosforyleerd door cycline D/CDK4 --> E2F vrij en actief --> reguleert cycline E (overgang naar S fase) en brengt p16 tot expressie (CKI) wat weer cycline D/CKD4 remt
66
Wat gebeurt er met p53 bij DNA schade aan een normale cel en wat zijn de gevolgen?
DNA schade aan normale cel --> p53 eiwit niveau omhoog --> p21 gen (CKI) wordt afgeschreven (komt tot expressie) --> cycline E/CDK2 wordt geremd --> G1/S arrest
67
Wat gebeurt er met p53 bij DNA schade aan een mutant p53 cel en wat zijn de gevolgen?
DNA schade aan mutant p53 cel --> p53 eiwit niveau NIET omhoog --> p21 gen (CKI) wordt NIET afgeschreven (komt tot expressie) --> cycline E/CDK2 wordt NIET geremd --> GEEN G1/S arrest --> replicatie beschadigd DNA --> mutaties
68
Wat krijgen patiënten met een defect ATM gen en wat zijn de kenmerken?
Patiënten: ataxia telangiextasia (AT)
Defect gen: ATM
* Overgevoelig voor röntgen stralen
* Kankerpredispositie
* Progressieve ataxia
* Autosomaal recessieve overerving
69
Wat gebeurt er als gevolg van ioniserende straling bij een normale cel?
Ioniserende straling (dubbelstrengs DNA breuken) op normale cel --> ATM kinase --> CHK2 activatie --> cycline A/CDK2 wordt geïnactiveerd --> remming van DNA synthese
70
Wat gebeurt er als gevolg van ioniserende straling bij een mutant ATM cel?
Ioniserende straling (dubbelstrengs DNA breuken) op mutant ATM cel --> GEEN ATM kinase --> GEEN CHK2 activatie --> cycline A/CDK2 blijft actief --> GEEN remming van DNA synthese --> replicatie beschadigd DNA --> mutaties
--> radioresistente DNA synthese (RDS) fenotype
Radioactief thymine toevoegen
71
Wat doet het RAD50 complex?
het vormt een brug tussen gebroken DNA moleculen
72
Wat is het nijmegen breuk syndroom (NBS)?
* Defect gen: Nbs1 of Rad50
* Microcefalie
* Groeivertraging
* Gonadale dysgenesie
* Immuun deficie5ntie
* Stralinsgevoeligheid
* Kankerpredispositie
* Autosomaal recessieve overerving
73
Hoe lang is de circadiane klok?
* Omlooptijd +- 25 uur
* Dagelijks gezet door licht, dus licht zet de klok dagelijks gelijk: photoentrainment, fotoreceptoren in het oog
74
Waar zit onze interne klok en wat gebeurt er als die beschadigd raakt?
In de suprachiasmatische nucleus (SCN) in de hypothalamus net boven de optus chiasme
Selectieve beschadiging van de SCN veroorzaakt aritmisch gedrag (slaap en temperatuur)
75
Welke genen zijn betrokken bij de interne klok?
Door cryptogenen uit de knocken zien we dat ze betrokken zijn bij de interne klok
Cry genen zijn essentiële klokgenen
76
Wat bepalen posttranslationele modificaties?
Posttranslationele modificatie (P, Ubi en Ac) bepalen stabiliteit PER en CRY --> timing ophoping kern- -> omlooptijd klok (Tau)
Kloksnelheid bepaalt chronotype (ochtend (korte klok) of avondmens (lange klok))
77
Wat doen klokgestuurde genen?
Klokgestuurde 'output' genen (CCGs) koppelen moleculaire klok aan gedrag, fysiologie, metabolisme (zelfde manier gereguleerd als klokgenen)
78
Wat zijn kenmerken van de centrale klok?
* In de neuronen van de SCN
* Iedere dag gelijk gezet met licht-donker cyclus door licht
79
Wat zijn kenmerken van perifere klokken?
* Overige (zenuw)weefsels en cellen
* Ongevoelig voor lichtprikkels
* Iedere dag gelijk gezet door de SCN: humorale factoren (bv hormonen), neurale stimuli
* Zelfde set klokgenen als SCN
Iedere cel in ons lichaam heeft een klok!
80
Zijn alle zoogdieren klok-gecontroleerd?
* In organen van de muis (en mens en andere zoogdieren) tot 20% van alle actieve genen onder circadiane controle
* Piek activiteit op verschillende momenten van de dag
81
Wat is het nut van de circadiane klok?
* Stelt onze lichaamsfuncties in staat te anticiperen op de specifieke behoefte op bepaalde momenten van de dag
* Geeft tijdstructuur aan onze cellen en organen
* Is evolutionair geconserveerd (alle weefsels en cellen op aarde hebben het)
82
Wat is circadiane desynchronie en waar kan het tot leiden?
Verschil lichaamstijd en geografische tijd
Acute klachten (tijdelijk)
* Slaaptekort
* Vermoeidheid
* Verminderde alertheid
* Verminderd prestatievermogen
83
Wat zijn lange termijn effecten van circadiane verstoring?
* Verhoogde kans op borstkanker, maar causal verband ontbreekt want nog epidemiologische studies --> dierstudies
* Chronische jet lag: versnelde tumorinductie
* Chronische ploegendienstarbeid: veranderd tumorspectrum --> ergere tumoren
84
Wat is chronotoxiciteit?
Toxisch effect is afhankelijk van het tijdstip van blootstelling
85
Waar zijn absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie afhankelijk van?
Absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie afhankelijk van circadiane klok --> chronofarmacokinetiek --> medicijnen op specifieke momenten geven
86
Wat suggereert een koppeling van de circadiane klok en de celcyclus?
Cellen vermenigvuldigen DNA en delen op vast moment van de dag
Suggereert koppeling circadiane klok en celcyclus
87
Waar werken veel chemotherapeutica op?
Veel chemotherapeutica werken op delende cellen
* Gezonde cellen --> bijwerkingen
* Tumorcellen
88
Wat houdt chronotherapie in?
Bijwerkingen voorkomen door een bepaald moment van de dag te behandelen/chemotherapie te geven, wanneer normaal weefsel er minder gevoelig voor is
Chronotherapeutica werken het efficiëntst op het moment dat zij het best door het lichaam wordt getolereerd
Door het gebruik van chronotherapie kunnen de bijwerkingen van chemotherapie verminderd worden
89
Wat is de checklist voor potentieel chronotherapeutische geneesmiddelen?
1. Vertonen de symptomen van een ziekte significante circadiane variatie?
2. Is de farmacokinetiek van het geneesmiddel afhankelijk van het tijdstip van toediening?
3. Vertoont het target orgaan circadiane variatie in de gevoeligheid voor het geneesmiddel (effectiviteit, toxiciteit)?
90
Waar is chronofitness mee geassocieerd?
Robuustheid circadiane rimtiek (chronofitness) geassocieerd met en hogere kans overleving, dus mensen met een sterkere klok hebben een grotere kans op overleving
91
Waar kan lifestyle verandering coaching bij helpen?
Lifestyle verandering (slaapgedrag, sport, ploegendienstarbeid) coaching kan helpen bij het verbeteren van de overleving
Dus luister naar je lichaamsklok!!
92
Waar bestaat het humane genoom uit?
* Kern genoom
* Mitochondriaal genoom
93
Wat zijn de kenmerken van mitochondriaal DNA?
* 16,5 kb
* Maximaal 1000 kopieën per cel: minder dan 1% van de totale hoeveelheid DNA
94
Uit hoeveel basen bestaat kern DNA?
3 x 10^9 basenparen
95
Wat zijn algemene kenmerken van het humane genoom?
* Er zijn ongeveer 20.000 eiwit-coderende genen, 1,5x zoveel als in het fruitvliegje
* Het 'proteoom' (de volledige set eiwitten gecodeerd door het humane genoom) is veek complexer dan dat van invertebrate organismen
* Slechts 1,5% van het humane genoom ontstaat uit coderende sequenties ('exoom'). Omdat de meeste genen veel en vaak grote intronen bevatten, wordt ten minste 1/3 deel van het genoom getranscribeerd
* Ongeveer de helft van het humane genoom bestaat uit hoog repetitief DNA afkomstig van transposabele elementen
* Deze elementen hebben hun transposon activiteit vrijwel geheel verloren
96
Hoe gelijk zijn wij aan elkaar?
* Per 1000 basen is er 1 verschillend: 0,1%
* Dat zijn in totaal 3x10^6 basen
97
Hoe gelijk zijn wij aan onze naaste verwanten?
* Per 100 basen is er maar 1 verschillend: 1%
98
Wat zijn toepassingen van de humane genoomsequentie?
* Identificeren en kloneren van ziektegenen, inclusief genen die betrokken zijn bij het ontstaan van kanker
* Identificeren van nieuwe genen die nauw verwant zijn aan bekende drug targets. Dit biedt de mogelijkheid nieuwe farmacologische stoffen te ontwikkelen, en oude te verbeteren.
* Het vinden van mutaties die overgevoeligheid voor medicijnen veroorzaken.
* Hierdoor kan de dosis worden aangepast en het risico van bijwerkingen aanzienlijk worden teruggebracht.
99
Analyse van genexpressie met microarrays en NGS
* cDNA microarrays: hoe worden de resultaten geïnterpreteerd
* Toepassing: diffuse large B cell lymphoma
* Toepassingen van NGS
100
NGS van RNA een veelzijdige benadering om genexpressie te begrijpen, want…
* Enorm dynamisch bereik (moleculen tellen)
* Gebruik van alternatieve promotoren
* Alternatieve splicing
* Allel-specifieke gen expressie
* Mutatie detectie
* Ontdekking van nieuwe exons, niet-coderende RNAs, micro-RNAs
101
Analyseren we proteomics?
* De hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA
* Kun je een expressieprofiel ook van eiwitten bepalen?
* Nog niet zo snel en gemakkelijk (van mRNA makkelijker), maar nieuwe en verbeterde technieken maken dit wel mogelijk
* Mogelijkheden voor analyse: eiwit-identificatie, -modificatie en -interactie mapping
102
Hoe gaat de eiwit identificatie met massa spectrometrie?
1. Eiwit of eiwitmengsel
2. Trypsine digestie --> breken in kleinere stukjes
3. Analyse met massa spectrometrie
4. Data vergelijking (humane genoom project)
5. Identificatie van het eiwit
103
Wat is trypsine?
Het darmenzym trypsine knipt de peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: op arginine R en lysine K
104
Hoe gaat massa spectrometrie?
Mengsel met peptides --> worden op sample plaat aangebracht --> korte puls met laser op schijnen --> deel van peptides raakt positief geladen, net als de sample plaat --> die moleculen willen weg van die plaat richting de negatieve plaat --> deel peptides raakt in gasfase --> vliegen weg van positief geladen plaat naar negatief geladen plaat --> kunnen daar door een gat --> krijgen snelheid en komen op detector --> signaal --> de kleine moleculen vliegen sneller richting detectorplaat dan de grotere, zwaardere, dus door de tijd te berekenen kun je de massa van de moleculen achterhalen (het is ook vacuüm)
105
Wat kan massa spectrometrie?
* Eiwit identificeren
* Eiwit kwantificeren (iets moeilijker)
* Bindende eiwitten identificeren
* Eiwitmodificaties identificeren (fosforylering etc.)
106
Hoe identificeren we bindende eiwitten?
* Maak een lysaat van de cellen en isoleer het eiwit of eiwit-DNA complex waarin je geïnteresseerd bent
* Elueer (spoelen, uitwassen) alle eiwitten die interactie hebben met dit eiwit (complex)
* Analyseer welke peptiden aanwezig zijn
107
Hoe sporen we eiwitmodificaties op?
Eiwitmengsel --> trypsine digestie --> verrijk voor fosfopeptiden (vooral peptiden hebben met fosfaatgroepen, het type die je wil hebben)--> identificeer mbv massa spectrometrie 8piek van peptide bekijken + massa van de modificatie)
108
Wat is metabolomics?
Metabolomics analyseert welke metabolieten voorkomen, bv in het bloed
109
Wat zijn de stappen van metabolomics?
1. Sample preparation: eventueel zuiveringsstap
2. Massa spectrometrie
3. Identificatie mbv computer
4. Herkennen van patroon
5. Wat is de biomarker?
Dus we proberen een biomarker te vinden om te bepalen of iemand de tumor heeft
110
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
* Regulatie van translatie
* Regulatie van eiwitstabiliteit (afbraak door proteases)
* Regulatie van eiwitmodificaties (fosforylering etc.)
111
Wat zijn microRNA genen?
* Genen die alleen coderen voor RNA
* MicroRNA wordt gecodeerd in het DNA, op maat geknipt door Drosha en Dicer (primicroRNA wordt premicroRNA door Drosha, dan microRNA door Dicer) en dan in het RISC complex ingebouwd --> dit kan binden aan mRNA --> vermindert translatie mRNA of breekt mRNA af
112
Dus wat doet microRNA?
* Regulatie van miRNA transcriptie
* Drosha knipt het tot pre-miRNA
* Transport naar cytoplasma
* Dicer knipt het tot miRNA
* 1 streng wordt ingebouwd in het RISC complex
* miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of mRNA afbraak
113
Wat is het belang van microRNA voor kanker?
* Bijna de helft van alle onderzoek richt zich op kanker
* Neerdere voorbeelden van directe beïnvloeding van kanker gerelateerde genen
114
Wat gebeurt er als miR-16 is verlaagd?
miR16 verlaagd --> Bcl2 verhoogd --> apoptose remming
miR16 verlaagd --> Cdc25A verhoogd --> celcyclus progressie
miR16 vaak verlaagd in tumoren, dus daar gebeurt dit --> positief voor tumor
115
Wat zijn de kenmerken van microRNA expressie en diagnose?
* microRNA microarrays kunnen de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen
* Dit kan ook met NGS
* Dit kan net als bij mRNA expressieprofielen geanalyseerd worden
* Goede diagnostische en prognostische waarde
* Combinatie met mRNA microarrays/sequencing, proteomics en metabolomics geeft zeer veel informatie
* Alle technieken duur, dus uiteindelijk zal voor een relatief goedkope combinatie gekozen worden, nog niet duidelijk welke dit zal worden
116
Wat kan je doen door korte stukjes microRNA in cellen te brengen?
Door korte stukjes microRNA in cellen te brengen gen van keuze uitzetten
117
Hoe kunnen we ingrijpen in de groei van kankercellen?
* CML philadelphia chromosoom: het remmen van de kinase activiteit van BCR-ABL met imatinib
* Nadelen:
→ Specificiteit vand dergelijke remmers is vaak een probleem
→ Er kan gemakkelijk resistentie ontstaan
→ Het zal vaak niet lukken om een geschikte remmer te vinden
118
Hoe kunnen we met mRNA ingrijpen in de groei van kankercellen?
· siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (RNA interferentie)
· RNA interferentie (RNAi) kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen
119
Wat zijn de voordelen van RNAi?
· Heel eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waar je de sequentie van weet
· Zeer specifiek
· Door het mRNA op verschillende plekken met siRNAs aan te pakken, zal resistentie niet gemakkelijk ontstaan
· Zeer geschikt voor hoge doorvoer analyses (RNAi libraries)
120
In welke fase van de celcyclus spenderen de cellen de meeste tijd?
G1
120
Wat zijn de nadelen van RNAi?
· Kan in principe alleen gebruikt worden om expressie te remmen
· We weten nog niet hoe we het siRNA in de gewenste cellen moeten inbrengen, dus specifiek in de tumor krijgen
121
Wat is de belangrijkste gebeurtenis in de S fase van de celcyclus?
Synthese van DNA
122
Wat is de verhouding in hoeveelheid DNA tussen menselijk fibroblasten in de G1 en de G2 fase van de celcyclus?
G1 = 0,5 x G2
123
Een 'checkpoint' in de celcyclus kan het beste worden beschreven als?
Specifieke station waar verdere voortgang van de celcyclus kan worden gestopt
124
Waarvoor dient het G2/M checkpoint tijdens de celcyclus?
Om ervoor te zorgen dat er geen DNA schade is opgetreden tijdens de S fase
125
Wat is de functie van de cyclines?
Ze activeren CDK (cycline afhankelijke kinase)
126
Wat is de juiste volgorde van fasen in de mitose?
Profase-metafase-anafase-telofase
127
Wat is de belangrijkste functie van tubuline tijdens de mitose?
Hieraan worden de chromosomen vastgekoppeld
128
Wat is paclitaxel?
Plactitaxel is een stof die bindt aan tubuline, waardoor microtubuli niet meer kunnen deploymeriseren en cellen dus geen vrij tubuline hebben waarmee nieuwe microtubuli gemaakt kunnen worden
129
In welke fase van de celcyclus zullen cellen zich ophopen als ze met Paclitaxel worden behandeld?
M (mitose)
130
Wat ontstaat er in het DNA als gevolg van de blootstelling van cellen aan ioniserende straling?
Dubbelstrengs breuken
131
Tijdens welke fase(n) van de celcyclus vindt homologe recombinatie (HR) plaats?
Tijdens S en G2 fase, want je hebt dan twee zuster chromatiden die je nodig hebt voor homologe recombinatie
132
Welke 2 methoden zijn er om cellen te bestuderen in de celcyclus?
* FACS
* Immunokleuring
133
Wat is FACS?
* Fluorescence activated cell sorting
* Celcyclusanalyse door kwantificering van het DNA-gehalte --> hoeveel DNA is er in een cel?
134
Hoe werkt FACS?
* DNA wordt gekleurd door een fluorescent DNA-bindend molecuul: propidium iodide (PI) --> dus dit toevoegen aan petrischaal met cellen
* Daarna analyseren met FACS
135
Wat is Aphidicolin?
Een DNA polymerase remmer
