week 2 Flashcards
Wat voor ziekte is kanker?
Opeenstapeling mutaties (stochastisch)
Kanker = ouderdomsziekte, vanwege opstapeling mutaties
Wat zijn puntmutaties?
- Kleine veranderingen op basepaar niveau
- Transities (purine –> purine (A/G); pyrimidine –> pyrimidine (C/T)) (A wordt G of C wordt T bv)
- Transversies (purine –> pyrimidine of vice versa)
- Kleine inserties/deleties
Wat zijn chromosomale afwijkingen?
- Grote veranderingen; waar te nemen op chromosomaal niveau
- Translocaties
- Amplificaties
- Deleties
- Numerieke afwijkingen
Wat kunnen de oorzaken zijn van DNA schade?
- Chemische instabiliteit
- Chemische verbindingen
- Biologische stoffen
- Fysische agentia
- Foutieve replicatie
Wat voor soort DNA beschadigingen zijn er?
- Chemische adducten
- Intrastreng crosslinks
- Interstreng crosslinks
- DNA strengbreuken
- Basepaar mismatches
Wat gebeurt er bij deaminatie van basen?
–> verandering complementariteit (replicatie induceert mutatie)
Welke chemische adducten verstoren de DNA dubbelhelix niet?
- Spontane hydrolyse
- Deaminatie
- Oxidatieve DNA schade
Wat zijn endogene stoffen?
- Endogene stoffen: zuurstof; oxidatieve DNA schade
Zuurstofradicalen: geproduceerd door metabole processen (energie productie)
Reactive Oxygen Species (ROS)
Wat is benzo(a)pyreen?
- Benzo(a)pyreen: aanwezig in sigarettenrook
Metabolisch geactiveerd: wordt omgezet in cellen in benzo(a)pyreen diol epoxide (BPDE) –> dit is de boosdoener –> kan binden aan DNA
Dit leidt dus weer tot verandering in complimentariteit (replicatie induceert mutatie)
Wat zijn de kenmerken van BPDE?
- Veroorzaakt chemische adducten die de DNA dubbelhelix verstoren
- BPDE reageert voornamelijk met G residue
- Tegenover G-BPDE wordt een A residue ingebouwd (ipv C)
- Veroorzaakt dus puntmutatie
Wat doet UV?
UV: intrastreng DNA beschadigingen door straling
UV veroorzaakt pyrimidine dimeren –> intrastreng, dus binnen 1 streng
Welke 2 soorten excisie (uithalen) reparatie mechanismen zijn er?
- Base Excisie Reparatie (BER)
- Nucleotide Excisie Reparatie (NER)
Wat is BER?
- Enzymatisch proces
- Herstel van kleine adducten (oxidatieve DNA schade, deaminatie van basen, ssDNA breuken)
Welke 3 stappen zijn er in de DNA schade reparatie?
- Herkenning DNA schade (DNA glycosylase)
- Excisie DNA schade (DNA glycosylase & AP-endonuclease)
- Herstel (DNA polymerase en ligase)
Wat houdt stap 1 van de DNA schade reparatie in?
DNA schade herkent door een schade-specifieke DNA glycosylase
* Deaminatie: uracil DNA glycosylase (UNG)
* UNG verwijdert ongewenste uracil
* Creëert een abasische plaats (AP) (plaats zonder een purine of pyrimidinebase)
Wat doen glycosylases?
- Glycosylases scannen het DNA
- Herkenning vreemd nucleotide door ‘base flipping’
Wat doet OGG1?
Oxidatieve DNA schade: 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)
* OGG1 hydrolyseert de N-glycosyl verbinding tussen deoxyribose en 8-oxoG * Creëert een abasische plaats (AP)
Hoe gaat BER?
- DNA schade herkent door een schade-specifieke
DNA glycosylase; creëert een abasische plaats - Endonuclease herkent AP-site en maakt een
knip in het DNA; AP-site wordt verwijdert. - Herstel: DNA polymerase en ligase
Wat is NER?
Herstel van grote adducten (cyclopyrimidine dimeren; 6-4 fotoproducten; bulky adducten)
Wat zijn de stappen van NER?
- Herkkenning van de DNA schade
- Openen van omringende DNA
- Verwijderen DNA schade (en aangrenzende gebieden van dezelfde streng)
- Herstel: DNA synthese/ligatie
Hoe wordt de dubbel helix geopend?
Dan komen eiwitten zoals XPG om een knip te maken in het DNA –> DNA schade weggehaald
Daarna hersteld door ligase
Maar er kan ook gebeuren dat de transcriptie geblokkeerd wordt –> zie rechterplaatje
Alle complexen terugduwen zodat DNA schade weer kan worden hersteld
Wat is XP en wat zijn de klinische symptomen?
Xeroderma pigmentosum (XP): autosomaal recessief
Wat zijn de klinische symptomen van XP?
* Zongevoeligheid
* Droge, harde huid
* Pigmentatie afwijkingen
* Cataract
* Huidkanker (>1000x↑)
* Versnelde neurologische achteruitgang
Wat is de oorzaak van XP?
- Ten minste 8 genen XPA,XPB,.. XPG
Hoe worden kinderen met XP genoemd en wat moeten ze allemaal doen?
Kinderen met XP worden ook wel ‘children of the moon’ genoemd
* rigoreuze bescherming tegen blootstelling aan UV- en zonlicht * speciale beschermende kleding (ESA/ NASA * regelmatige dermatologische controle en behandeling (incl. chirurgie) * Camp Sundown
Wat is CS en wat zijn de klinische symptomen?
Cockayne syndroom (CS): autosomaal recessief
Wat zijn de klinische symptomen van CS?
* Zongevoeligheid
* Groei achterstand
* Neurologische achteruitgang
* Netvliesafwijkingen
* Versnelde veroudering
* GEEN huidkanker
Wat is de oorzaak van CS?
- Mutatie in 2 genen CSA, CSB
- Samen met XP: XPB,XPD, XPG
Hoe worden DNA beschadiginen hersteld?
- ‘templates’ voor DNA schade herstel
- Belangrijk voor nauwkeurig herstel
- We kunnen de complementaire DNA streng gebruiken als template
- Of zusterchromatide (in meeste gevallen gebruikt, alleen in S of G fase, wanneer DNA al gedupliceerd is)
- Homologe chromosoom
Welke 2 mechanismen heb je om dubbelstrengs DNA breuken te herstellen?
Je hebt niet-homologe DNA eind verbinding en homologe recombinatie om dubbelstrengs DNA breuken te herstellen
Welke 2 fundamenteel verschillende manieren zijn er om dubbelstrengs DNA breuken te herstellen?
- Niet-homologe DNA eindverbinding –> direct aan elkaar ligeren van de twee uiteinden van een DNA breuk, gebruikt geen ‘template’ –> onnauwkeurig herstel
- Homologe recombinatie –> uitwisseling van DNA strengen tussen DNA moleculen, gebruikt voornamelijk het zusterchromatide –> nauwkeurig herstel (vnw gebruik template)
Wat zijn kenmerken van niet-homologe DNA eindverbinding?
- KU70/80 herkent DNA breuk
- Samen met DNA-PKcs en ligases maakt het de breuk weer aan elkaar –> leidt tot kleine deletie
Een defect in niet-homologe DNA eindverbinding kan resulteren in radiosensitiviteit bv SCID patiënten (severe combined immune deficiency)
Wat zijn de kenmerken van antilichamen en niet-homologe DNA eindverbinding?
- Chromosomale organisatie van het immunoglobuline locus
- Een B cel specifiek eiwit, RAG1/RAG2 introduceert DNA dubbelstrengs breuken in het immunoglobuline locus
- Niet-homologe DNA eindverbinding koppelt D en J segmenten
- Niet-homologe DNA eindverbinding koppelt V en DJ segmenten
- De onnauwkeurigheid van niet-homologe DNA eindverbinding vergroot de diversiteit aan antilichamen
Wat zijn homologe chromosomen?
Twee vergelijkbare maar niet identieke kopieën van elk chromosoom
Na replicatie (onderdeel celcyclus) per chromosoom twee identieke zusterchromatiden
Hoe verloopt herstel door homologe recombinatie?
Dubbelstrengse DNA breuk –> breuk herkenning en verwerking tot enkelstrengs ‘staart’ –> base paring tussen gebroken en identieke intacte zusterchromatide –> synthese ontbrekend DNA en ligatie van gebroken strengen –> resoluctie van verbonden zusterchromatiden –> RAD51 eiwitmoleculen vormen een filament op de enkelstrengs ‘staart’ –> het RAD51 eiwitfilament bevordert baseparing tussen het gebroken en intacte zusterchromatide –> het gedrag van RAD51 na het ontstaan van DNA schade wordt beïnvloed door de BRCA1 en BRCA2 eiwitten
Wat vertonen BRCA2 deficiënte cellen?
BRCA2 deficiente cellen vertonen een verhoogde frequentie van chromosomale afwijkingen
BRCA2 is belangrijk voor genomische stabiliteit
Wat kan leiden tot genomische instabiliteit?
Fouten bij homologe recombinatie dubbelstrengs DNA breuk herstel kunnen leiden tot genomische instabiliteit
Fouten bij niet-homologe DNA eindverbinding dubbelstrengs DNA breuk herstel kunnen leiden tot genomische instabiliteit
Waar kan verlies van zijn bij het gebruik van een homologe chromosoom als template?
Dus mogelijk verlies van heterozygositeit (LOH) bij homologe chromosoom als template
Welke replicatie fouten kunnen er zijn?
- Dna polymerase proofreading fouten
- Translesie synthese
Welke mechanismen zijn er voor de nauwkeurigheid van DNA replicatie?
- Base selectie: zorgen voor juiste base op juiste plek
- Proofreading
- Mismatch reparatie
Wat doet proofreading?
Proofreading is DNA polymerase checkt of de juiste basen tegenover elkaar staan.
DNA polymerase kan nucleotide inbouwen en kan nucleotide weghalen en opnieuw inbouwen (dit laatste is de proofreading)
Met baseselectie en proofreading heb je 99,9% efficiëntie
Wat gebeurt er bij een mismatch en een mismatchreparatie?
Dit is een mismatch –> DNA polymerase had het niet door en is verder gegaan met inbouwen
Bepaalde eiwitten herkennen de schade –> binden –> openen het –> enzymen (exonuclease) gaan deel strand weghalen –> DNA polymerase alles weer vullen –> mismatch weggehaald
Welke technieken kan je gebruiken bij een mismatch reparatiedefect aantonen?
- Immunohistochemische kleuring (op eiwitten die bij de mismatch reparatie horen –> die het oplossen)
- Microsatellite instability assay (MSI): microsatellieten bestaan uit korte repeterende sequenties, meestal di-, tri-, tetranucleotide repeats. Defecte mismatchreparatie leidt tot microsatellite instabiliteit.
Wat doe je bij een microsatellite instabiliteit analyse?
PCR op DNA van tumor en normaalweefsel
Wat zijn de oorzaken van coloncarcinoom?
- Sporadisch 75%
- Familiair belast 18%
- Lynch syndroom 5%
- IBD 1%
- FAP 1%
Wanneer kan er sprake zijn van Lynch/erfelijke colorectaal carcinoom?
Gereviseerde Bethesda criteria
- CRC < 50 jaar
- Tweemaal CRC of CRC icm andere Lynch geassocieerde tumor (synchroon/metachroon) bij één patiënt
- CRC met MSI < 60 jaar
- CRC bij een patient met een of meer eerste/tweedegraads familieleden met Lynch syndroom geassocieerde tumor (tenminste eenmaal < 50 jaar)
- CRC bij een patient met twee of meer eerste/tweedegraads familieleden met een Lynch syndroom geassocieerde tumor
Welke Lynch syndroom geassocieerde tumoren zijn er?
baarmoeder, eierstok, hogere urinewegen
maag, alvleesklier, galwegen, dunne darm
talgklieren, hersenen
Wat kan de klinisch geneticus onderzoeken?
- stamboom
- bepalen of en bij wie in de familie moleculair onderzoek gestart moet worden
–> aangedane persoon, beschikbaar tumorweefsel; DNA-repair schade? - voor- en nadelen moleculair onderzoek bespreken
- moleculair onderzoek; kiembaanmutatie (#tumor!)
- adviezen
Wat zijn de risico’s van Lynch syndroom?
- Life time risico op CRC tot 70%
→ Vaak <50 jaar
→ Tumoren meestal rechtszijdig gelokaliseerd: aggressiever
→ In 25% meer dan 1 tumor bij diagnose- Vaak slecht gedifferentieerd
- veel mucus, zegelring-cellen
tumor-infiltrerende lymfocyten, MSI, neoantigenen
in de tumor
· Life time risico endometriumcarcinoom tot 55%
· Andere geassocieerde tumoren 1-15%
Wat zijn de surveillance adviezen bij Lynch syndroom?
Bij Lynch syndroom (GEEN maligniteit) wordt aanbevolen vanaf de leeftijd van 25 jaar 1 keer per 2 jaar colonoscopie te verrichten
Wat is de gynaecologische surveillance bij Lynch?
· Voor het endometriumcarcinoom is de werkgroep van mening dat voor vrouwen in de leeftijd van 40-60 jaar jaarlijkse surveillance in de vorm van transvaginale echoscopie met afname van endometrium sample voor histologisch onderzoek in de vorm van een microcurettage, zinvol is.
· Voor het ovariumcarcinoom is de werkgroep van mening dat voor vrouwen in de leeftijd van 40-60 jaar, bij de jaarlijkse surveillance voor endometriumcarcinoom, tevens de ovaria kunnen worden beoordeeld.
· Ovariële surveillance alleen wordt door de werkgroep niet aanbevolen wegens gebrek aan effectiviteit.
· ♀#♂ bij Lynch!!
Hoe gaat de overige surveillance van kankers bij Lynch?
· Maag
· Alvleesklier
· Galgangen
· Dunne darm
· Talgklieren
· Hogere urinewegen
· Hersenen
· Allemaal niet op screenen
· Want:
· Frequentie laag
· Sensitiviteit en specificiteit testmethodiek(en)
· Geen bewezen effect op klinische uitkomst
Wat is het beleid bij Lynch geassocieerd CRC?
· Invloed van leeftijd
· Bij Lynch geassocieerd colorectaalcarcinoom dient een totale colectomie met een ileorectale anastomose (IRA) te worden overwogen vanwege het verhoogde risico op een metachroon coloncarcinoom tot 22-32%.
· Bij patiënten > 60 jaar met Lynch geassocieerd colorectaal carcinoom is een partiële colectomie de voorkeursbehandeling, aangezien de overlevingswinst van een totale colectomie waarschijnlijk zeer gering is.
· De therapeutische handeling is op hogere leeftijd veel meer bepalend voor de prognose dan de profylactische ingreep.
Welke preventieve overwegingen zijn er bij Lynch?
· De werkgroep is van mening dat preventieve chirurgie voor endometrium- en ovariumcarcinoom een optie kan zijn.
· Alleen screenende preventieve overwegingen, geen invasieve voor CRC
· Er zijn geen gegevens over chemo/immuno preventie bij (high-risk) patiënten met Lynch
Wat doet etoposide?
Etoposide remt topoisomerase II
Etoposide ‘bevriest’ eiwit-DNA complex –> wel openen, niet meer aan elkaar zetten –> dubbelstrengs DNA breuk met aan uiteinden covalent gebonden eiwit
–> kan effectief zijn bij testiskanker
Wat is synthetische letaliteit?
Als je een behandeling geeft die DNA schade oplevert kan die op 2 manieren gerepareerd worden: 1 manier zowel in tumorcellen als in normale cellen, of een manier die niet in tumorcellen gedaan kan worden –> als je dan die eerste manier remt dan gaan de tumorcellen dood
Wat doet poly ADP ribose polymerase 1 PARP1?
- Bindt aan enkelstrengs DNA breuken
- Modificeert eiwitten met poly ADP ribose
- PARP1 maakt reparatie van enkelstrengs breuken efficiënter
We kunnen PARP1 remmen, wat gebeurt er dan?
Enkelstrengs breuken blijven langer bestaan –> replicatie van een DNA molecuul met een enkelstrengs breuk resulteert in een éénzijdige dubbelstrengs breuk –> geen herstel door niet-homologe DNA eind verbinding, want geen tweede DNA uiteinde –> dus homolge recombinatie essentieel voor herstel DNA replicatie-geassocieerde éénzijdige dubbelstrengs breuk –> RAD51 eiwitten komen op gebroken stukje en zorgen dat de replicatievork weer goed wordt
Wat zijn de kenmerken van BRCA geassocieerde borstkanker?
- Erfelijke vormen van borstkanker: 5-10% van de geconstateerde gevallen
- Dragers met BRCA1 of BRCA2 mutaties (heterozygoot) hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van kanker: borst-, ovarium- en prostaatkanker
- Inactivatie van het gezonde allel in tumorecellen voornamelijk door LOH (loss of heterozygosity)
Het fenotype van BRCA1 en BRCA2 mutatie dragers erft autosomaal dominant over
Wat zijn kenmerken van tumoren in BRCA mutatie dragers (defect HR)?
- Base excise reparatie en enkelstrengsbreuken
- DNA dubbelstrengsbreuken in de contect van DNA replicatie
- PARP remmers kunnen helpen: proof of principle synthetische letaliteit
- Concept nu ook voor andere drugs en tumortypen onderzocht
Wat is hyperthermie?
Het verhitten van tumoren tijdens de behandeling
–> hyperthermie vergroot effectiviteit radiotherapie voor bv blaas cervix en anale tumoren
Waarom werkt hyperthermie als anti-tumor therapie?
Heeft invloed op homolge recombinatie pathway
RAD51 is belangrijk voor dubbelsttrengs DNA breukherstel door homologe recombinatie
Normaal:
* RAD51 eiwitmoleculen vormen een filament op de enkelstrengs ‘staart’
* Het RAD51 eiwitfilament bevordert baseparing tussen het gebroken en intacte zusterchromatide
* Het gedrag van RAD51 na het ontstaan van DNA schade wordt beïnvloed door de BRCA1 en BRCA2 eiwitten
Toen werd gevonden dat bij bestraling (röntgen) van normale cellen er een ophoping is van RAD51. Er is echter geen ophoping van RAD51 op DNA schade in BRCA2-deficiënte cellen
Hyperthermie verhindert de ophoping van RAD51 op DNA schade
Milde verhitting van cellen resulteert in de afbraak van het BRCA2 eiwit –> door te verhitten defect veroorzaken in homologe recombinatie
Wat doet een combinatie van hyperthermie en PARP remmer?
Combinatie hyperthermie en PARP remmer remt de tumorgroei (muizenmodel), want geen HR dus goede reactie op PARP remmer
Is nog niet in de kliniek gebruikt
Wanneer komen er symptomen bij kanker?
Symptomen bij kanker pas bij >1 gram (omvang gemuteerde cel 1 cmˆ3)
Hoe lang is de periode tussen het ontstaan van kanker en de eerste klachten?
5 jaar
Hoeveel patiënten krijgen de diagnose kanker per jaar per huisartsenpraktijk (2350 patiënten)?
11 patiënten
6 mannen, 5 vrouwen
Prevalentie: 24 mannen, 40 vrouwen
Stervensbegeleiding: 5 patiënten per jaar
Huisarts denkt gemiddeld 3x per dag aan diagnose kanker en diagnosticeert het 1x per maand
Wat is de kans op malingiteit bij de huisarts (lymfadenopathie)?
1,1%
Wat is de kans op maligniteit bij de specialist (lymfadenopathie)?
43%
Wat zijn de kenmerken van het symptoom rectaal bloedverlies?
- Jaarlijks heeft 20% van de bevolking een episode
- Meest voorkomende oorzaak: geen idee
Wanneer denken aan kanker?
- Aanwezigheid (ziektespecifieke) alarmsymptomen
- Aanwezigheid risicofactoren
- Ongewoon of langer beloop van ‘onschuldige’ aandoeningen
Wat zijn alarmsymptomen van kanker?
algemeen/metabool
- vermoeidheid
- gewichtsverlies
- koorts
- algehele malaise
primaire tumor
- zwelling
- rectaal bloedverlies
- veranderd defecatiepatroon
metastasen
- lymfeklierzwelling
- bospijn
Wat is DNA sequencing?
Het bepalen van de volgorde van de 4 nucleotiden- ‘basen’- waaruit het DNA molecuul bestaat
Wat is PCR?
Om DNA zichtbaar te kunnen maken moet er veel meer extra kopieën gemaakt van worden, dit doe je mbv PCR, zo kan je DNA analyseren
Welke voorbeelden zijn er voor de toepassing van DNA-sequencing in de oncologie?
- Differentiaal diagnostiel
- Therapiekeuze
- Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
- Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) in samenwerking met klinische genetica
- Weefselidentificatie
Hoe gaat Sanger sequencing?
- Mix van primer en nucleotiden die fluorescerend gelabeld zijn, deze bouw je achter elkaar in op je DNA molecuul –> met laser aflezen –> volgorde nalopen
- 1 klein stukje DNA (exon van een gen) per analyse van 1 patiënt
Bij NGS kan je veel stukjes DNA in een keer doen en van meerdere patiënten in 1 run
Welke 2 manieren zijn er om te sequencen?
- Amplicon based sequencing
- Hybridization based
Hoe gaat amplicon based sequencing?
Adapters aan primers maken, zodat je nog weet wat je moet sequencen/hebt gesequenced
Hoe gaat hybridization based sequencing?
Niet eerst PCR zoald bij amplicon, maar eerst DNA in stukjes knippen, dan heb je ook stukje target DNA –> adapters aan vast maken –> met probe eraan vast stukje DNA wat interesse heeft eruit halen –> de rest wegwassen –> dus alleen sequencen wat je nodig hebt
–> de regio’s van interesse daar doe je weer adapters aan –> zitten primerlocaties op en een plek waar een flow cell aan kan binden –> die flow cell is je template voor het sequencen, alle DNA fragmenten gaan daar aan binden –> andere eind bind aan primer –> brug vormen –> soort PCR, DNA zelfde als je fragment (dus 2x) –> wordt herhaald –> dit sequencen, want meer fragmenten, betrouwbaardere sequencing
Volgorde wordt bepaald door de verschillende kleurtjes (net als Sanger)
Hoe haal je patiënten uit elkaar bij sequencen?
–> heleboel fragmenten in 1x tegelijk sequencen
Meerdere patiënten tegelijk sequencen –> barcodes gebruiken voor herleiden identiteit fragmenten –> komen op adapters –> DNA moleculen herleiden naar patiënt
Waarom kunnen we niet altijd een mutatie vinden?
- Soms niet genoeg DNA moleculen
- Biopt, dus ook veel andere cellen –> isoleren tumorcellen soms moeilijk –> mutatie niet te vinden
We willen graag minimaal 20% tumorcellen hebben in onze DNA mix om een mutatie te vinden.
Wat is Variant Allel Frequentie (VAF) en waar is het afhankelijk van?
Hoe vaak een variant op een specifieke positie voorkomt tov de referentie sequentie
Afhankelijk van:
* Gen (oncogen vs tumorsuppressorgen)
* Tumorcelpercentage
Wat is coverage (deep sequencing)?
Aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is. Hoe hoger de coverage, hoe ‘deeper’ (beter) gesequenced.
Wat is NGS?
Next generation sequencing; gebruik van relatieve kleine gen panels met hotspot locaties van genen
Wat is WES?
Whole exome sequencing; sequencen van alle exonen (coderende regio’s) van alle genen
Wat is WGS?
Whole genome sequencing; sequencen van het totale genoom
Wat zijn kenmerken van NGS?
- Single molecule
- Duizenden fragmenten/analyse
- Output 1 – 20 x 10^9 basen
- Weinig DNA nodig (~20 ng)
- Hoge gevoeligheid (1-2%)
- Poolen van samples (barcode)
- Bio-informatica vereist
Wat zijn kenmerken van Sanger sequencing?
- Mix van moleculen
- 1 fragment/analyse
- Output max 1000 basen
- Veel DNA nodig
- Lage gevoeligheid (20%)
- Poolen niet mogelijk
- Eenvoudige analyse
Wat betekent proportionaliteit?
Staat het middel in een te rechtvaardige verhouding tot het doel
Wat betekent subsidiariteit?
Altijd minst ingrijpende middel gebruiken om het doel te bereiken
